PAK4與RCBTB1相互作用促進胰腺癌細胞增殖

于昕博，黃昌偉，路天琦，袁瑩，李曉東

（中國醫科大學 1.臨床一系；2.生命科學學院分子細胞生物學教研室，國家衛生健康委員會細胞生物學重點實驗室暨教育部細胞生物學重點實驗室，沈陽 110122）

胰腺癌惡性度極高，是常見的消化系統腫瘤之一。目前胰腺癌在中國發病率顯著上升，已成為我國十大腫瘤之一［1］。然而，胰腺癌起病隱匿、預后極差，在我國高居腫瘤致死率第六位［2］。因此，對胰腺癌的研究更顯迫切。p21激活激酶4（p21-activated kinase 4，PAK4）是PAK家族的Ⅱ類代表性成員，其羧基末端包含具有催化活性的絲/蘇氨酸激酶域，通過結合和磷酸化下游靶蛋白，在多種信號通路中發揮重要作用［3］。PAK4在膀胱癌、骨肉瘤等多種腫瘤中存在基因擴增、蛋白過表達，被認為是腫瘤細胞信號轉導的關鍵因子之一［4-5］。已有研究［6-8］顯示，PAK4在正常胰腺組織中不表達或低表達，而在胰腺癌中過表達，參與細胞遷移、侵襲、耐藥等過程，尤其在胰腺癌細胞的增殖中發揮重要作用。RCC1和BTB結構域包含蛋白1（RCC1 and BTB domain containing protein 1，RCBTB1）是一種細胞增殖相關蛋白，包括RCC1結構域和BTB結構域，其中RCC1結構域可發揮小G蛋白Ras相關核蛋白鳥嘌呤交換因子的作用，而BTB結構域則與蛋白相互作用有關［9］。近期研究［10］發現，RCBTB1刺激平滑肌肉瘤細胞體外有絲分裂和脂肪肉瘤細胞增殖，表現為促進細胞增殖的癌基因效應。本課題組前期研究通過質譜法篩選出PAK4互作蛋白RCC1。而RCBTB1包含RCC1結構域并促進細胞增殖，與前期研究［5，11］報道的PAK4促進多種腫瘤細胞增殖的效應一致，提示PAK4可能通過與RCBTB1的RCC1結構域相互作用促進細胞增殖。本研究探討了PAK4與RCBTB1的相互作用及其在胰腺癌細胞增殖過程中的作用和機制，以豐富PAK4在胰腺癌發生、發展過程中的作用，為研究胰腺癌細胞增殖機制提供新的基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

胰腺癌細胞株Panc-1由本實驗室保存，細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，培養條件為37 ℃、5% CO2，實驗選用對數生長期細胞。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM（美國Gibco公司）；胎牛血清（中國Hyclone公司）；引物（中國Invitrogen公司）；限制性內切酶、電泳凝膠回收試劑盒（日本TaKaRa公司）；質粒提取及純化試劑盒（中國Promega公司）；PAK4（美國Proteintech公司）；ECL發光試劑盒（中國Tanon公司）；DAPI、碘化丙啶（美國Sigma-Aldrich公司）；山羊血清（中國中杉金橋生物技術有限公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所）。

1.3 實驗方法

1.3.1 PCR及表達質粒構建：PCR擴增體系包含1 mg/L DNA模 板0.5 μL，5 U/μL Pyrobest DNA聚 合 酶0.125 μL，上下游引物各1.0 μL，2.5 mmol/L dNTP mixture 2.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，重蒸餾水補至25 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30次循環；72 ℃延伸10 min。擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳及成像分析。收集DNA；加入載體、DNA裂解酶、DNA連接酶構建表達質粒；收集表達質粒，酶切后瓊脂糖凝膠電泳，驗證質粒是否構建成功。

1.3.2 免疫共沉淀實驗：收集細胞、提取蛋白并測定濃度，將蛋白分為Input、IgG組和IP組。IgG組和IP組分別加入IgG及相應抗體，4 ℃孵育3 h，加入IPbeads，孵育過夜；500g離心2 min，棄上清，RIPA細胞裂解液洗滌3次，10 min/次；吸干IP-beads，加入2×loading buffer，與Input一起煮沸變性，13 000g離心2 min；取上清液，進行Western blotting檢測。

1.3.3 免疫熒光實驗：細胞接種于12孔板；加入4%多聚甲醛固定20 min；PBST（Triton X-100溶于PBS）透膜20 min；羊血清工作液封閉2 h；一抗孵育過夜；PBST（TWEEN-20溶于PBS）洗滌3次，10 min/次；二抗避光孵育1 h；PBST洗滌3次，10 min/次；DAPI避光孵育15 min；PBST洗滌3次，10 min/次；封片，于激光共焦掃描顯微鏡下觀察。

1.3.4 CCK-8實驗：胰酶消化細胞并重懸為1.5×104/mL濃度的細胞懸液；100 μL/孔接種到96孔板，培養過夜；每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h；使用超微量微孔板分光光度計在450 nm波長下測定每孔光密度值。

1.3.5 碘化丙啶染色和流式細胞術：胰酶消化細胞并重懸為細胞懸液；加入5 mL 75%冷乙醇，4 ℃過夜；4 ℃、1 000g離心5 min，棄乙醇；生理鹽水（含1%牛血清蛋白）洗滌2次，4 ℃、1 000g離心5 min，棄上清；800 μL生理鹽水重懸細胞；4 ℃、1 000g離心5 min，棄上清；加入250 mL碘化丙啶溶液，4 ℃避光孵育30 min；采用流式細胞術對樣品進行檢測。

1.3.6 Western blotting：收集細胞并提取蛋白；Bradford法蛋白定量；10% SDS-PAGE瓊脂糖凝膠電泳分離20 μg總蛋白；濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，4℃恒壓過夜；5%脫脂奶粉封閉1 h；一抗孵育過夜；二抗孵育2 h；ECL顯色拍照，GAPDH為內參。

1.4 統計學分析

采用Graphpad Prism 8軟件進行統計學分析，細胞增殖實驗獨立重復3次，結果取均值并進行t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR獲取RCBTB1基因編碼區全長片段并構建表達質粒

通過PCR獲得RCBTB1基因編碼區全長片段（1 595 bp），并成功插入pCDNA3.1-Flag載體。見圖1。

圖1 PCR擴增目的基因RCBTB1及其原核表達載體的構建Fig.1 RCBTB1 of PCR amplified target gene and its prokaryotic expression vector

2.2 免疫共沉淀實驗確定PAK4與RCBTB1在細胞內的相互作用

胰腺癌細胞Panc-1裂解后用PAK4抗體進行免疫沉淀（IgG為對照），之后分別用RCBTB1抗體與PAK4抗體檢測沉淀物蛋白表達。結果表明，PAK4與RCBTB1在胰腺癌細胞內存在相互作用。見圖2。

圖2 PAK4與RCBTB1在胰腺癌細胞內的相互作用Fig.2 Interaction of PAK4 and RCBTB1 in pancreatic cancer cells

2.3 免疫熒光實驗探究PAK4與RCBTB1的定位和共定位位置

在胰腺癌細胞中轉染Flag-RCBTB1質粒，PAK4/Alexa-546、Flag/Alexa-488抗體免疫熒光處理后，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。結果顯示，PAK4（紅色）與RCBTB1（綠色）在細胞核（DAPI，藍色）中以及核周胞質區域有顯著共定位。見圖3。

圖3 PAK4與RCBTB1的定位和共定位位置Fig.3 Localization and co-localization of PAK4 and RCBTB1

2.4 CCK-8實驗探究過表達PAK4、RCBTB1對胰腺癌細胞增殖的影響

在胰腺癌細胞Panc-1中分別轉染Flag-PAK4、Flag-RCBTB1、同時轉染Flag-PAK4和Flag-RCBTB1（單獨轉染Flag作為對照），CCK-8實驗結果顯示，過表達PAK4、過表達RCBTB1均促進細胞增殖，同時過表達PAK4和RCBTB1顯著促進細胞增殖。在胰腺癌細胞Panc-1中轉染si-PAK4（si-Control作為對照），同時共轉染Flag-RCBTB1，利用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖。結果表明，胰腺癌細胞沉默PAK4表達后，過表達RCBTB1不能促進細胞增殖。見圖4。表明PAK4通過與RCBTB1相互作用促進細胞增殖。

圖4 PAK4、RCBTB1過表達及兩者同時過表達和沉默PAK4并過表達RCBTB1對細胞增殖的影響Fig.4 Effects of overexpression of PAK4 or RCBTB1，co-overexpression of PAK4 and RCBTB1，and PAK4 silence and oveexpression of RCBTB1 on cell proliferation

2.5 流式細胞術檢測過表達PAK4、RCBTB1對胰腺癌細胞周期的影響

在胰腺癌細胞Panc-1中分別轉染Flag-PAK4、Flag-RCBTB1，同時轉染Flag-PAK4和Flag-RCBTB1（單獨轉染Flag作為對照）。流式細胞術結果顯示，轉染Flag、Flag-PAK4、Flag-RCBTB1及同時轉染Flag-PAK4和Flag-RCBTB1的細胞G0～G1期分別為73.36%、70.81%、70.85%、67.88%，S期分別為17.46%、20.00%、19.21%、27.27%，表明過表達PAK4、RCBTB1均促進細胞進入S期，同時過表達PAK4和RCBTB1顯著促進細胞進入S期。在胰腺癌細胞Panc-1中轉染si-PAK4（si-Control作為對照），同時共轉染Flag-RCBTB1。流式細胞術結果顯示，共轉染si-Control和Flag-RCBTB1、共轉染si-PAK4和Flag-RCBTB1的細胞G0～G1期分別為70.44%、72.13%，S期分別為19.51%、18.54%，表明當胰腺癌細胞沉默PAK4表達后，過表達RCBTB1促進的細胞進入S期效果不明顯。見圖5。

圖5 PAK4、RCBTB1過表達及二者同時過表達和沉默PAK4并過表達RCBTB1對細胞周期的影響Fig.5 Effects of overexpression of PAK4 or RCBTB1，co-overexpression of PAK4 and RCBTB1，and PAK4 silence and overexpression of RCBTB1 on cell cycle

2.6 Western blotting檢測cyclin D1表達水平

在胰腺癌細胞Panc-1中分別轉染Flag-PAK4、Flag-RCBTB1，同 時 轉 染Flag-PAK4和Flag-RCBTB1（單獨轉染Flag作為對照）。Western blotting結果顯示，過表達PAK4、過表達RCBTB1時cyclin D1表達均增加，同時過表達PAK4和RCBTB1時cyclin D1表達顯著增加。在胰腺癌細胞Panc-1中轉染si-PAK4（si-Control作為對照），同時共轉染Flag-RCBTB1。Western blotting結果顯示，沉默PAK4和過表達RCBTB1時cyclin D1表達未增加。見圖6。表明PAK4通過與RCBTB1相互作用促進cyclin D1表達。

圖6 PAK4、RCBTB1過表達及二者同時過表達和沉默PAK4并過表達RCBTB1對cyclin D1表達的影響Fig.6 Effects of overexpression of PAK4 or RCBTB1，co-overexpression of PAK4 and RCBTB1，and PAK4 silence and overexpression of RCBTB1 on expression of cyclin D1

3 討論

胰腺癌惡性度高，早期確診率極低，病程發展迅速，手術死亡率較高。研究［12］表明，胰腺癌患者5年生存率僅為9%，大部分患者初次診斷后生存期小于1年。

PAK4是關鍵的腫瘤細胞信號轉導因子之一，在多種腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用。PAK4可通過激活蛋白激酶B/胞外信號調節蛋白激酶途徑促進核因子κB的核積累和轉錄活性，從而促進胰腺癌細胞增殖［8］。RCBTB1是新發現的PAK4相互作用蛋白，已有證據表明其在肉瘤細胞增殖過程中發揮作用［10］。研究［13］報道，PAK4可介導紡錘體上Ras相關核蛋白依賴性復合物的裝配，在細胞增殖過程中發揮重要作用。以上證據提示，PAK4與RCBTB1的相互作用可能在胰腺癌細胞增殖過程中發揮重要作用。

本研究采用免疫共沉淀實驗證實了胰腺癌細胞內源表達的PAK4與RCBTB1的相互作用，免疫熒光實驗結果表明二者在胰腺癌細胞核核周區域存在顯著的共定位，以上均證實PAK4與RCBTB1在胰腺癌細胞內的相互作用。PAK4與RCBTB1明顯共定位于細胞核和核周胞質中，且結合RCBTB1家族成員的生物學功能，提示兩者可能對胰腺癌細胞有絲分裂和細胞周期進程產生影響。CCK-8實驗結果顯示，過表達PAK4或RCBTB1均可促進胰腺癌細胞增殖，兩者同時過表達時促進作用更為顯著；沉默PAK4表達后，RCBTB1促進增殖的作用消失，以上結果均表明兩者的相互作用促進胰腺癌細胞增殖。在此基礎上，本研究還檢測了胰腺癌細胞周期及相關細胞周期因子的改變，發現無論是過表達PAK4還是RCBTB1，均可促進胰腺癌細胞S期的比例，且cyclin D1表達明顯升高，當兩者同時過表達時這種作用更為明顯；而當沉默PAK4表達后，即便過表達RCBTB1，也不會促進胰腺癌細胞進入S期。

綜上所述，本研究結果表明，PAK4與RCBTB1相互作用可以通過增加胰腺癌細胞 cyclin D1表達，促進細胞進入S期，從而促進細胞增殖。本研究結果揭示了PAK4與RCBTB1的相互作用促進胰腺癌細胞增殖及可能的機制，為PAK4介導胰腺癌發生、發展提供了新的理論基礎。