BMP-2/bFGF雙基因轉染的骨髓間充質干細胞復合生物陶瓷骨促進兔橈骨缺損修復

韓操，張麗娜，顏南，王正東

（沈陽醫學院 1.附屬中心醫院手外科，沈陽 110024；2.附屬中心醫院重癥醫學科，沈陽 110024；3.醫學應用技術學院康復教研室，沈陽 110034；4.基礎醫學院解剖教研室，沈陽 110034）

骨缺損是指由于外傷或手術造成的部分骨質損傷或缺失，需要植骨等介入技術進行修復的嚴重疾病。骨缺損可導致骨不連、患肢功能恢復差，甚至截肢［1］，因此急需研發骨缺損的修復方法。雙相陶瓷樣生物骨（biphasic ceramic-like biologic bone，BCBB）可修復動物橈骨缺損，有良好的生物相容性和骨傳導能力，是具有巨大潛力的異質骨源性材料［2］。骨髓間充質干細胞（bone marrow stem cell，BMSC）具有自我更新能力和多項分化潛能，能在不同條件下分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞等，是骨組織工程的理想種子細胞［3］。BMSC的分化進程受多種細胞因子調控，骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是一種重要的骨誘導因子，可誘導BMSC成骨分化［4］。堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是成纖維細胞生長因子家族的基本成員，可促進BMSC的遷移、增殖和分化［5］。但是，目前關于BMP-2和bFGF轉染的BMSC對骨修復能力影響的研究較少。促紅細胞生成素產生肝細胞（erythropoietin-producing hepatocyte，Eph）配體ephrin-B2是由破骨細胞表達的一種跨膜配體，與和它結合的酪氨酸激酶受體Eph受體B4（EphB4）共同控制骨穩態。EphB4和ephrin-B2的相互作用產生雙向信號，影響表達EphB4的成骨細胞和表達ephrin-B2的破骨細胞，導致成骨細胞的形成增強，破骨細胞的形成受到抑制，共同導致骨形成。但EphB4/ephrin-B2的調控機制尚不清楚，BCBB是否通過EphB4/ephrin-B2信號通路參與撓骨修復未見報道。

本研究將雙表達BMP-2/bFGF的慢病毒轉染兔BMSC后，將該細胞復合到陶瓷骨中，植入骨缺損兔體內，探討動物模型中BMP-2/bFGF雙基因轉染的BMSC復合生物陶瓷骨對骨缺損的治療作用，以及該作用與EphB4/ephrin-B2信號通路的關系，為臨床骨缺損的治療提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 兔BMSC的分離培養

4月齡雌性新西蘭白兔購自北京維通利華公司，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉。切開腿部皮膚和肌肉層，取出股骨，去除軟組織，剪斷股骨，暴露髓腔。用含1%青鏈霉素的PBS沖洗，再用洗脫液洗脫，200目濾網過濾，500g離心10 min。去掉上清，加入DMEM培養基和等體積Percoll細胞分離液（北京索萊寶公司），重懸細胞，1 000g離心30 min。將細胞分離液液面中的細胞吸出，用含10%胎牛血清的DMEM培養基（美國Gibco公司）在37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，通過免疫熒光檢測細胞CD44和CD34陽性率對細胞進行鑒定。

1.2 細胞轉染

取上述培養、鑒定后的兔BMSC，用胰酶消化并鋪板，培養過夜后，將BMP-2/bFGF過表達的慢病毒（上海吉凱基因公司）滴加到細胞中，放入37 ℃培養箱中培養24 h；換液后繼續培養，待細胞長滿后，加入嘌呤霉素進行篩選，篩選后的細胞繼續培養，用于后續實驗。

1.3 細胞轉染效率驗證

通過Western blotting驗證兔BMSC的BMP-2/bFGF基因轉染效率。收集細胞，將RIPA裂解液（上海碧云天公司）加入細胞中，冰上孵育30 min，超聲破碎儀超聲，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清，BCA試劑盒（上海碧云天公司）檢測蛋白濃度，加入蛋白緩沖液（上海碧云天公司），煮樣5 min，上樣于聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉；BMP-2（1∶1 000稀釋）和bFGF（1∶1 000稀釋）抗體（美國Abcam公司）4 ℃孵育過夜，PBST洗膜，山羊抗兔二抗（1∶5 000稀釋，美國Invitrogen公司）室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL試劑盒（上海碧云天公司）進行化學發光，并使用Image J進行灰度分析。

1.4 動物分組和取材

將50只4月齡新西蘭白兔隨機分為對照組（Control組）、模型組（Model組）、生物陶瓷骨組（BCBB組）、BMSC組（BCBB+BMSC組）和BMP-2/bFGF雙 基因轉染的BMSC組（BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組），每組10只。除Control組外，各組兔禁食12 h。免耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉，固定于手術臺，于前肢一側橈骨中段剪毛備皮。消毒后在橈骨外側剝離骨膜，暴露骨面，并用骨鉆垂直制造缺損。Model組不植入BCBB，BCBB組植入BCBB，BCBB+BMSC組植入與未轉染的BMSC復合的BCBB，BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組植入與BMP-2/bFGF雙基因轉染的BMSC復合的BCBB。逐層縫合，術后連續7 d肌肉注射青霉素。繼續飼養，待造模后8周，脫頸椎法處死兔，取出缺損側橈骨組織，部分保存于-80 ℃，另一部分固定于4%多聚甲醛中。

1.5 實時定量PCR檢測

對缺損部位撓骨組織中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor-2，Runx2）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和Ⅰ型膠原（collagen Ⅰ，Col Ⅰ）基因進行PCR檢測，以GAPDH為內參。骨組織中加入裂解液裂解后，收集各樣本于無酶EP管中，使用RNA試劑盒提取總RNA，并測定純度。再按照PrimeScriptTMRT reagent kit說明進行反轉錄，獲得cDNA。以稀釋后的cDNA為模版，進行實時PCR。PCR反應條件：95 ℃起始變性30 s，進行40個循環，95 ℃變性5 s，60 ℃復性30 s。引物序列：ALP，F 5’-AACGTGGCCAAGAAC ATCATCA-3’，R 5’-TGTCCATCTCCAGCCGTGTC-3’；Runx2，F 5’-GCACCCAGCCCATAATAGA-3’，R 5’-T TGGAGCAAGGAGAACCC-3’；OPN，F 5’-CAAATAC CCAGATGCTGTGGC-3’，R 5’-TCCTGGCTGTCCAC ATGGTC-3’；Col Ⅰ，F 5’-AGGGCTCCAACGAGATC GAGA-3’，R 5’-AGGAAGCAGACAGGGCCA-3’；GAPDH，F 5’-CAGGGCTGCCTTCTCTTGT-3’，R 5’-T CCCGTTGATGACCAGCTTC-3’。

1.6 HE染色

將4%多聚甲醛固定的橈骨組織在15% EDTA溶液中浸泡3周，每5 d更換1次EDTA溶液。蒸餾水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明及石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。實驗前60 ℃烘干切片4 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水洗滌。蘇木素染色，自來水洗滌，1 %鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，碳酸鋰返藍，流水沖洗，伊紅染色。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 免疫熒光實驗

將上述石蠟切片依次放入二甲苯和梯度乙醇中脫蠟至水，EDTA緩沖液微波抗原修復，恢復至室溫后，PBS洗滌3次，驢血清室溫封閉30 min，Col Ⅰ、OPN抗體（1∶100稀釋，英國Abcam公司）4 ℃過夜孵育，第2天PBS洗滌3次，山羊抗兔熒光二抗（1∶3 000，英國Abcam公司）室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，DAPI染色15 min，PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 Western blotting

將RIPA裂解液（上海碧云天公司）加入骨膜組織中，冰上孵育30 min，勻漿機勻漿，后續步驟與上述轉染效率驗證一致，所用抗體為EphB4和ephrin-B2（1∶1 000，英國Abcam公司）。

1.9 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析和Tukey事后檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔BMSC的分離和鑒定

分離后的BMSC經免疫熒光檢測，發現體外培養的兔BMSC表面CD44表達為陽性，CD34表達為陰性。見圖1。

圖1 兔BMSC的免疫熒光鑒定 ×100Fig.1 Identification of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells by immunofluorescence ×100

2.2 BMP-2/bFGF雙基因轉染兔BMSC

慢病毒轉染后的BMSC經Western blotting鑒定，發現與未轉染細胞相比，轉染細胞中BMP-2和bFGF蛋白表達均顯著上調（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 Western blotting檢測雙基因轉染兔BMSC后BMP-2和bFGF的表達Fig.2 Post transfection identification of BMP-2 and bFGF in rabbit bone marrow stem cells by Western blotting

2.3 BMP-2/bFGF雙基因轉染的兔BMSC復合生物陶瓷骨對橈骨Runx2、Col Ⅰ、ALP、OPN表達的影響

實時定量PCR結果顯示，與Control組相比，Model組兔橈骨組織Runx2、Col Ⅰ、ALP、OPN表達水平顯著降低（P＜ 0.05）；與Model組相比，BCBB組、BCBB+BMSC組、BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Runx2、Col Ⅰ、ALP、OPN表達水平顯著升高（P＜0.05）；與BCBB組和BCBB+BMSC組相比，BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Runx2、Col Ⅰ、ALP、OPN表達水平顯著升高（P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 Runx2、Col Ⅰ、ALP和OPN在兔橈骨組織中的相對表達量Fig.3 Relative expression of Runx2，Col Ⅰ，ALP，and OPN in rabbit radius

2.4 BMP-2/bFGF雙基因轉染的兔BMSC復合生物陶瓷骨對橈骨Lane-Sandhu組織學評分的影響

與Control組相比，Model組兔橈骨組織Lane-Sandhu組織學評分顯著降低（P＜ 0.05）；與Model組相比，BCBB組、BCBB+BMSC組和BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Lane-Sandhu組織學評分顯著升高（P＜0.05）；與BCBB組和BCBB+BMSC組相比，BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Lane-Sandhu組織學評分顯著升高（P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 兔撓骨Lane-Sandhu組織學評分Fig.4 Lane-Sandhu histological scores of rabbit radius

2.5 BMP-2/bFGF雙基因轉染的兔BMSC復合生物陶瓷骨對橈骨組織形態的影響

采用HE染色檢測骨組織形態。Control組兔橈骨組織骨細胞排列整齊，組織結構正常；Model組兔橈骨組織可見纖維結締組織填充缺損區，無成骨表現；BCBB組和BCBB+BMSC組兔橈骨組織可見大量條索狀板層骨形成，骨細胞排列整齊；BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織可見骨板層呈同心圓排列，骨小梁粗大，破骨細胞增生活躍。見圖5。

圖5 兔撓骨形態學觀察 ×100Fig.5 Rabbit radial tissue morphology ×100

2.6 BMP-2/bFGF雙基因轉染的兔BMSC復合生物陶瓷骨對橈骨Col Ⅰ和OPN表達的影響

免疫熒光結果顯示，與Control組相比，Model組兔橈骨組織Col Ⅰ和OPN表達顯著降低（P＜ 0.05）；與Model組相比，BCBB組、BCBB+BMSC組、BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Col Ⅰ和OPN和表達顯著升高（P＜ 0.05）；與BCBB組和BCBB+BMSC組相比，BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Col Ⅰ和OPN表達顯著升高（P＜ 0.05）。見圖6。

圖6 兔撓骨中Col Ⅰ和OPN的免疫熒光結果 ×400Fig.6 Col Ⅰ and OPN in rabbit radial bone visualized by immunofluorescence ×400

2.7 BMP-2/bFGF雙基因轉染的兔BMSC復合生物陶瓷骨對橈骨骨膜EphB4和ephrin-B2水平的影響

Western blotting結果顯示，與Control組相比，Model組兔橈骨組織骨膜EphB4和ephrin-B2水平顯著降低（P＜ 0.05）；與Model組相比，BCBB組、BCBB+BMSC組骨組織中EphB4和ephrin-B2水平無統計學差異（P＞0.05）；與Model組、BCBB組 和BCBB+BMSC組 相 比，BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織中EphB4和ephrin-B2水平顯著升高（P＜ 0.05）。

3 討論

目前，大面積骨缺損的治療仍是臨床難題，自體骨移植和異體骨移植是兩種主要治療方法，但它們都有一些難以克服的缺點。在過去的幾十年里，人們開發了大量人工合成生物材料用于修復骨缺損。其中，基于磷酸鈣的生物陶瓷是最有前途的用于臨床的生物材料，它們具有良好的生物相容性和骨誘導性。雖然在不添加任何生長因子或細胞的情況下，骨誘導多孔磷酸鈣陶瓷可用于治療動物的大面積骨缺損，在一定程度上可與自體骨移植相媲美，但其在促進骨細胞分化和成骨方面的療效還有待開發。

圖7 Western blotting檢測兔撓骨骨膜中EphB4和ephrin-B2的表達水平Fig.7 Levels of EphB4 and ephrin-B2 in rabbit radial periosteum

近年來，與干細胞復合形成的組織工程骨的研發與應用受到關注。由于BMSC具有多向分化能力，因此被作為組織工程的種植細胞用于臨床研究，但BMSC移植后僅部分轉化為成骨細胞，存在成骨能力較弱等缺點［6］。因此，增強BMSC的成骨分化并提高其成骨效率是目前亟待解決的問題。BMP-2是最有效的骨誘導蛋白之一，它促進成骨細胞分化，從而促進骨修復；bFGF在細胞增殖和血管生成中發揮重要作用，是骨修復過程中的關鍵因子［7］。因此，本研究采用慢病毒載體方法雙轉染BMP-2和bFGF到兔BMSC中，成功建立了穩定過表達BMP-2和bFGF的BMSC。將該細胞與陶瓷骨復合后植入骨缺損兔體內，發現BMP-2/bFGF雙基因轉染的BMSC復合生物陶瓷骨能夠顯著改善撓骨缺損情況，同時上調缺損橈骨組織Runx2、ALP、OPN和ColⅠ的表達，促進組織再生修復，提高Lane-Sandhu組織學評分，提示BMP-2/bFGF雙基因轉染的BMSC可顯著增加BMSC對骨缺損的修復作用。

ColⅠ是骨中最豐富的有機基質成分，是骨的主要組成成分［8］。OPN是一種細胞外酸性蛋白，對正常的早期愈合組織形成和新生血管是必要的［9］。ALP是參與骨組織礦物形成的糖蛋白，是參與骨形成的重要因子［10］。Runx2被認為是骨發育和成骨細胞分化的主要調節因子之一［11-12］。本研究發現，BMP-2/bFGF雙基因轉染的BMSC復合生物陶瓷骨增加缺損橈骨組織中Runx2、ColⅠ、ALP和OPN的表達，提示BMP-2/bFGF雙基因轉染的BMSC可增加BMSC對成骨的促進作用。

EphB4/ephrin-B2信號通路是骨改建過程中成骨細胞-破骨細胞間信號傳遞的一條新通路，這條信號通路是通過破骨細胞表面表達的ephrin-B2和成骨細胞表達的EphB4跨膜蛋白受體間產生雙向信號傳導，從而實現信息的傳遞和互相調控。Ephrin-B2通過c-Fos/NFATc1抑制破骨細胞功能，而EphB4通過Dlx5、Osx和Runx2促進成骨細胞功能。EphB4通過增強RhoA的活性，誘導成骨細胞的分化。EphB4/ephrin-B2參與的信號通路促進骨形成，同時抑制過度的骨吸收，因而對于維持骨體內平衡起至關重要的作用［13］。本研究發現，BMP-2/bFGF雙基因轉染的BMSC復合生物陶瓷骨增加缺損橈骨組織中ephrin-B2和EphB4的表達，提示BMP-2/bFGF雙基因轉染的BMSC 可能通過激活EphB4/ephrin-B2信號通路發揮促進成骨的作用。

綜上所述，本研究發現BMP-2/bFGF雙基因轉染的BMSC復合生物陶瓷骨對兔橈骨缺損存在修復作用，其機制與激活骨組織中的EphB4/ephrin-B2信號通路有關。