增食欲素A誘導(dǎo)的自噬在人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29凋亡中的保護(hù)作用

溫晶，常曉岑，郭丹，都健

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌代謝內(nèi)科，沈陽 110032）

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升且年輕化的趨勢［1-2］。研究表明，增食欲素（Orexins）在結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。Orexins包括Orexin A和Orexin B，分別通過激活受體OX1R和OX2R發(fā)揮作用［3］。原發(fā)性結(jié)直腸癌、肝轉(zhuǎn)移瘤及多種人結(jié)腸癌細(xì)胞系中均存在OX1RmRNA的表達(dá)。研究表明，Orexin A可影響肝癌［4］、前列腺癌［5］、胰腺癌［6］和結(jié)腸癌［7］等多種腫瘤細(xì)胞的代謝與活性，能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，還可與5-氟尿嘧啶協(xié)同促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡［7］。本研究組前期研究［8］發(fā)現(xiàn)，Orexin A能通過ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡和自噬。

自噬，又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［9］。自噬活性的變化與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)［10］，但其在抗腫瘤治療中的作用及機(jī)制目前仍存在爭議。研究［11-13］表明，某些已知能夠激活細(xì)胞凋亡的抗腫瘤藥物也可引起細(xì)胞自噬，自噬抑制劑可增強(qiáng)這些藥物的抗腫瘤活性。此時(shí)，自噬作為保護(hù)劑，可防止細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。相反，自噬也可通過誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡殺死細(xì)胞［14］。本研究組已對(duì)Orexin A誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道［6，15］，但目前Orexin A誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞自噬及其與凋亡的關(guān)系未見報(bào)道。本研究擬探討Orexin A同時(shí)對(duì)HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和自噬的誘導(dǎo)作用，并進(jìn)一步探討其相互關(guān)系和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

Orexin A、二甲基亞楓、四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（美國Sigma公司）；氯喹（chloroquine，CQ）、anti-Beclin-1（美國Sigma-Aldrich公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）；β-actin多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（美國Santa Cruz公司）；anti-LC3、anti-caspase 3（美國Cell Signaling Technology公司）；SB334867（美國Tocris公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞獲自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海），用含10%胎牛血清、L-谷氨酰胺（2 mmol/L）及青霉素（50 μg/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）的RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。每2～3 d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以維持其處于對(duì)數(shù)生長期。

1.2.2 細(xì)胞活力測定：將HT-29細(xì)胞（2×103/孔）接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。為了使細(xì)胞周期同步，將細(xì)胞血清剝奪24 h，并用不同濃度Orexin A（0，1×10-9，1×10-8，1×10-7mol/L）處理細(xì)胞24 h。加入MTT溶液（0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。除去培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜（100 μL/孔），置于搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm和650 nm處測量各孔的吸光度值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測：用AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒定量凋亡細(xì)胞，通過BD Accuri TM C6流式細(xì)胞儀（美國BD Pharmingen公司）評(píng)估細(xì)胞凋亡情況。在不含血清的培養(yǎng)基中用不同濃度的Orexin A（0，1×10-9，1×10-8，1×10-7mol/L）處理細(xì)胞24 h?；?qū)⒓?xì)胞分組給藥處理24 h，即對(duì)照組，Orexin A（1×10-7mol/L）組，CQ（20 μmol/L）組，Orexin A（1×10-7mol/L）+CQ（20 μmol/L）組。將細(xì)胞（1×105）用PBS洗滌2次，用AnnexinV-FITC（5 μL）和PI（10 μL）在室溫下避光染色15 min。通過熒光激活細(xì)胞分析計(jì)數(shù)通過FITC標(biāo)記的AnnexinV染色的細(xì)胞數(shù)，以確定凋亡率。

1.2.4 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體：細(xì)胞分為對(duì)照組和Orexin A（1×10-7mol/L）組。分別處理24 h后，胰蛋白酶消化和收集細(xì)胞，2.5%磷酸鹽緩沖的戊二醛固定，1%磷酸鹽緩沖的四氧化鋨后固定，包埋，切片，乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染。用JEM-1200EX透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 Western blotting檢測蛋白表達(dá)：藥物處理后收集HT-29細(xì)胞，1 000g離心10 min，PBS沖洗2次，加入細(xì)胞裂解液（10 mmol/L TrisHCl pH7.4，10 mmol/L edeticacid pH8.0，0.5% TritonX-100），冰浴中裂解30 min。4 ℃、12 000g離心10 min，收集上清液，Bradford法測每組蛋白濃度，制備蛋白樣品。上樣行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗封閉過夜，再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗封閉液封閉1.5 h，DAB顯色，掃描記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Orexin A抑制HT-29細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

應(yīng)用不同濃度Orexin A（0，1×10-9，1×10-8，1×10-7mol/L）處理HT-29細(xì)胞，MTT檢測結(jié)果顯示，Orexin A以劑量依賴的方式抑制HT-29細(xì)胞生長。與對(duì)照組比較，1×10-8和1×10-7mol/L濃度的Orexin A能夠誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞活力顯著降低（P＜ 0.05）。流式細(xì)胞儀測定結(jié)果顯示，Orexin A處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡顯著增加。與對(duì)照組比較，Orexin A（1×10-7mol/L）能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率增加1.5倍（P＜ 0.05），見表1。

表1 Orexin A對(duì)HT-29細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響Tab.1 Effect of Orexin A on cell viability and apoptosis in HT-29 cells

2.2 HT-29細(xì)胞中自噬泡形成

應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，與對(duì)照組比較，Orexin A（1×10-7mol/L）處理后的HT-29細(xì)胞中可見許多微小液泡，即自噬泡。見圖1。

圖1 Orexin A誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞中自噬泡形成Fig.1 Orexin A induced formation of autophagic vacuoles in HT-29 cells

2.3 Orexin A誘導(dǎo)LC3-Ⅱ積累并上調(diào)Beclin-1的表達(dá)

LC3-Ⅱ與自噬體膜密切相關(guān)，被用作監(jiān)測自噬的可靠標(biāo)志物。Western blotting結(jié)果顯示，Orexin A以時(shí)間和劑量依賴的方式上調(diào)了LC3-Ⅱ和自噬關(guān)鍵蛋白Beclin-1的表達(dá)，見圖2。

圖2 Orexin A對(duì)HT-29細(xì)胞中LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of Orexin A on LC3 and Beclin-1 levels in HT-29 cells

2.4 抑制自噬可促進(jìn)Orexin A誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞凋亡

應(yīng)用CQ和Orexin A單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞，結(jié)果表明，CQ增強(qiáng)了Orexin A誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞凋亡，見圖3A、3B。為了進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果，用Western blotting檢測了caspase-3的裂解情況，結(jié)果顯示，Orexin A裂解前caspase-3至其活性形式，見圖3C。

圖3 氯喹誘導(dǎo)的自噬抑制對(duì)Orexin A誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Chloroquine-induced inhibition of autophagy enhanced orexin A-induced apoptosis in HT-29 cells

3 討論

隨著新輔助化療的開展，結(jié)腸癌的5年生存率得到了一定程度的提高［16］。研發(fā)低毒性抗腫瘤藥物已成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。研究［17-18］表明，Orexin A參與調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的病理過程，但其對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和自噬的作用及二者之間的關(guān)系尚不明確。

自噬最主要的細(xì)胞學(xué)特征是細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞質(zhì)囊泡［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，Orexin A處理HT-29細(xì)胞24 h后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)封閉的雙層膜囊泡，即自噬體。Western blotting結(jié)果也顯示，Orexin A處理后，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，且LC3表達(dá)水平以劑量和時(shí)間依賴的方式增加。LC3的這些特異性變化已被公認(rèn)為哺乳動(dòng)物發(fā)生自噬的標(biāo)志［20］。表明Orexin A誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞死亡中，有細(xì)胞發(fā)生了自噬性活化。Beclin-1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因，也是介導(dǎo)哺乳動(dòng)物自噬發(fā)生的特異性基因［21］。在本研究中，Orexin A以劑量依賴的方式增加了HT-29細(xì)胞中Beclin-1的表達(dá)，表明Beclin-1參與了Orexin A誘導(dǎo)的自噬。

自噬在哺乳動(dòng)物的感染、腫瘤及神經(jīng)退行性疾病等多種病理過程中發(fā)揮重要作用［22］。研究［11］表明，自噬參與了抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制。自噬能夠通過抑制抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來保護(hù)部分腫瘤細(xì)胞；同時(shí)，部分腫瘤細(xì)胞也可因發(fā)生自噬性活化而死亡［23］?？鼓[瘤治療中自噬與凋亡的關(guān)系及其具體機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，Orexin A處理HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞后，能誘導(dǎo)其發(fā)生自噬性活化和凋亡。自噬抑制劑CQ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞活力減低。推測Orexin A作用于HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞后，自噬作為一種防御機(jī)制被誘導(dǎo)發(fā)生，用于清除Orexin A殺傷的細(xì)胞器及產(chǎn)生的有害物質(zhì)，延緩凋亡的發(fā)生，從而發(fā)揮保護(hù)作用。因此，精細(xì)調(diào)控自噬將在結(jié)腸癌治療方面具有廣闊的前景。