月季三倍體育種方法概述

丁艷麗 李珍 付涌玉

摘要：為了培育不結果或少結果的藤本月季新品種，降低植株營養消耗，節約管理成本，促進月季開花，提高其觀賞性，選定適合的月季品種作為父母本，進行雜交試驗。首先對父本花粉生活力和發芽率的測定和母本開花生物學特性的觀測，接著開展了有性雜交和播種育苗，最后從形態和DNA方面對雜種進行鑒定。

關鍵詞：三倍體;雜交

現代月季通常指薔薇科、薔薇屬中一類四季開花的雜種品種群，主要包括四大類：雜種香水月季、豐花月季、微型月季和藤本月季。現代月季經過200多年的發展，已逐漸形成了龐大的類群，特別是歐美及日本等月季發達國家的新品種更是層出不窮，令人矚目?，F代月季的品種群（2n=2x、3x、4x、x、5x、6x、8x），種類繁多，來源廣泛。

國內月季育種現狀：月季的育種最早始于中國，其最早記錄是公元960 年把Rosa chinensis 用于月季雜交。北宋時代，我國月季品種廣栽于洛陽、山東、兩淮、蘇州、揚州等地，當時已經開展播種天然授粉種子并由實生苗中選育新品種的活動。到宋代，僅洛陽就有41個月季品種，達到了世界水平。但是從明代開始我們落伍了，野生資源、古老品種遭到嚴重破壞和流失，直到不久前我國的月季育種還基本處于停滯或緩慢發展狀態。我國月季育種工作開始于新中國成立以后，20世紀50～70年代，我國自育品種‘黑旋風’、‘上海之春’、‘浦江朝霞’相繼問世，上海、北京、杭州等地新品種選育工作開始發展。1986年中國月季協會成立后，大力倡導新品種的培育工作，全國許多城市相繼成立了月季協會，高校、科研機構以及月季愛好者開始重視月季的育種工作，我國月季育種和發展進入了新時代。1957～2016年的60年間，我國自育新品種共計455個。

植物的多倍體情況在植物界里隨處可見，如馬鈴薯、小麥、棉花、無籽西瓜、香蕉、番茄、巨峰葡萄等等。多倍體育種是指通過人工的方法將植物染色體組進行加倍，或是直接從自然界中選育染色體組加倍的突變體，從而獲得新品種的方法。多倍體的特點有巨大性、品質與產量提高、生理特性改變、遺傳變異性、不孕性與可孕性等特點。由于多倍體的諸多特點，多倍體育種在植物育種學和分子生物學方面早已成為研究熱門。多倍體植物品種的育種方法主要有兩大類，一類是植物在自然界中自然加倍，人們根據自己的需求，到自然界中去發現自然加倍的物種，將其直接引種過來;另一類就是通過人工誘導的方法產生。人工誘導多倍體的方法比較多，如使用溫度刺激、機械創傷、嫁接、電離輻射、射線等方法誘使植物加倍的物理方法;如使用秋水仙素等化學誘變劑誘導植物加倍;如仿效自然加倍的途徑，使用傳統雜交技術、組織培養技術、細胞融合技術進行多倍體育種。

目前國內的月季育種目標主要集中在花色育種、花香育種、抗性育種，育種方法主要是雜交育種、誘變育種、分子育種。在國內，月季的倍性育種少有報道。北京聯合大學特殊教育學院鮑平秋團隊采用四倍體藤本月季‘多特蒙德’作為母 本 ，二倍體‘北京俏’‘北京紅’作為父本，進行雜交育種，培育出了三倍體雜交新種‘特嬌’、‘特俏’、‘多嬌’、‘多俏’。三倍體月季，一方面可以使結實率降低;另一方面，可以獲得更好的觀賞效果，同時降低水肥消耗、節約養護管理成本，提高經濟效益。南京農業大學王康的專業碩士論文是對古老月季‘月月粉’的四倍體誘導、鑒定和特性研究。

1 確定三倍體育種目標

三倍體月季，一方面可以使結實率降低;另一方面，可以獲得更好的觀賞效果，同時降低水肥消耗、節約養護管理成本，提高經濟效益。培育三倍體月季，要按照園林植物育種目標多樣性、高效性、季節性、兼用性等特點，遵循育種目標的預見性、可操作性、可檢驗性等特點，來選擇適合的父母本，已達到預訂的育種目標。

2 根據育種目標，確定父本與母本

2.1 母本的選擇

選擇母本需要考慮到它的開花生物學特性，包括天然授粉結實率、自花授粉結實率、孤雌生殖結實率、天然授粉果實平均結子率及種子萌發率，選擇結實率高，種子萌發率高，優點突出的二倍體或四倍體月季品種作為母本。

2.2 父本的選擇

在選擇父本時，除要求花粉量大、花粉萌發率高外，還要兼顧性狀遺傳規律。根據育種目標和現有材料，我們選擇適合的二倍體或者四倍體月季品種作為父本。

2.2.1 父本花粉生活力測定

花粉采集：摘取選定的父本植株上含苞待放、花瓣抱合的花蕾，在陰涼干燥的室內，用鑷子分別取出的花蕾中的花藥，將花藥放置在硫酸紙上，自然干燥，待花藥開裂散粉后收集花粉，進行花粉生活力的測定。

用解剖針在載玻片上撒少量花粉，滴1滴I-IK溶液，蓋上蓋玻片，用吸水紙將多余藥液吸干，將載波片放在顯微鏡下觀察花粉染色情況。每種花粉觀察3個視野，分別統計花粉染色情況，從而得出各種花粉生活力狀況。

2.2.2 父本花粉發芽率測定

（1）父本花粉發芽率測定方法：在500ml容量的燒杯中倒入100ml蒸餾水，放在微波爐中加熱煮開，加入0.4g瓊脂和10mg蔗糖，攪拌均勻后，繼續加熱煮開，加入0.01g硼酸，用玻璃棒攪拌均勻。

（2）制片：用玻璃棒蘸少許培養基，趁熱滴入凹形載玻片的凹槽內，等培養基冷卻后，用解剖針均勻撒上少量花粉粒。

（3）培養：在培養皿下面墊一層濾紙，向濾紙上滴水直至濾紙吸足水，以保持濕度，將制好的載玻片放入培養皿內，蓋好培養皿，放在25℃的恒溫箱內進行培養。

（4）鏡檢：花粉培養一段時間后，取出載玻片，放在顯微鏡下觀察花粉萌發情況。每種花粉觀察4個視野，以花粉管長度等于或大于花粉直徑長度為準，分別記錄每個視野花粉的萌發數，計算花粉的發芽率。

3 月季三倍體雜交育種的技術

3.1 雜交親本選擇

親本應具有我們所需要的優良性狀和特性，優點多缺點少，而且親本的優缺點要能互相彌補。親本來源在地理上應較遠，生態類型不同，這樣可以豐富雜種遺傳性，增強雜種優勢。

3.2 母株和花朵的選擇

根據育種目標的要求，選擇生長健壯、發育良好的作為母株。去雄的花朵以選擇植株中上部和向陽的花為好。每枝保留的花朵數一般以3～5朵為宜，多余的去掉，以保證雜種種子的營養。

3.3 去雄

去雄時間都應在雌雄蕊未成熟時，可先用手輕輕剝開花蕾，用鑷子剔去花中的雄蕊，仔細檢查每片花瓣的基部，以免留有零星散生的雄蕊。小心操作，千萬不要損傷雌蕊。

3.4 套袋

為避免計劃外植物花粉干擾，去雄后立即套上袋子。袋子兩端開口，頂端向下卷折，用回形針夾住，下端應縛在老枝上，因為當年生枝脆易斷。套袋后掛上紙牌，用鉛筆寫明去雄日期。

3.5 授粉

待柱頭分泌黏液發亮時即可授粉。為確保授粉成功，最好連續授粉2～3次。授粉工具一般用毛筆、棉花球;特別少的花粉，用圓錐形橡皮頭授粉。授粉后應立即封好套袋，并在紙牌上注明雜交組合、雜交日期、授粉數等。

3.6 雜交后的管理

雜交后，要細心管理，創造良好的、有利于雜交種子發育的條件，并注意觀察記載，及時防治病蟲害，防止人為的破壞。

4 雜交后代播種、選育

4.1 播種

雜交果實后，逐個剖開，將種子裝入透氣的牛皮紙袋中。再將牛皮紙袋沙藏在用滅菌靈藥液浸泡消毒過的泥瓦盆中沙藏，沙藏用的沙子是新的細河沙。裝好盆后，將瓦盆放在建筑物的北墻根，用草袋覆蓋，經常檢查，保證沙子的濕度在60%左右。在第二年春季，將種子取出，進行盆播。

4.2 選育

因為雜交幼苗比較弱，一定要倍加呵護，做好水肥管理，以保證雜交后代的成活率。由于月季是異花授粉，F1就出現了分離，所以選擇在F1進行。雜種植物至少要經過3～5年的形狀觀察、比較、分析，最終做出性狀鑒定。

5 雜交后代倍性鑒定

5.1 形態鑒定

對雜種苗主要從株形、株高、小葉數、葉色、花期、花色、花瓣數、花徑、花型、天然授粉結實率方面進行觀察。將雜種苗與父母本比較它們之間的關系。

5.2 氣孔觀察

分別取父母本與雜種苗的葉片，用解剖針、眼科鑷在葉背面剝下一層表皮，將撕下的表皮放在載玻片上，滴一滴清水，蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下觀察氣孔情況。觀察氣孔大小，氣孔分布密度，并進行比較。

5.3 流式細胞分析儀測定方法

組培苗的獲得：

從父母本和雜交種苗上選取直徑0.5～0.8cm的新生枝條，用洗衣粉溶液輕輕洗滌，再用自來水沖洗干凈，然后放在濾紙上吸干枝條上的自來水。在超凈工作臺上將枝條剪成約2cm左右的帶芽的莖段，每個莖段要帶一個節。用70%的酒精消毒1min，用消毒過的蒸餾水振蕩沖洗3遍，再用0.1%的升汞溶液消毒2min，然后用消毒過的蒸餾水沖洗3次，再用70%的酒精消毒1min，用消毒過的蒸餾水振蕩沖洗3遍，再用0.1%的升汞溶液消毒2min，然后用消毒過的蒸餾水沖洗5次。消毒后，將莖段放在無菌濾紙上，接種在初代培養基上，3周后等芽長到1cm左右時，將芽切下接種到繼代增殖培養基上進行增殖。增殖30～45d后即可以將無根苗切離接種到生根培養基上進行生根培養。

稱取100mg試管苗嫩莖及幼葉，在滴有2ml提取緩沖液的培養皿中研碎，260目尼龍網過濾，離心（1000r/min）漂洗3次，獲得細胞核懸液。將細胞核懸液離心處理后，去掉上層清液，加入染色緩沖液，暗處常溫下染色30min。500目尼龍網過濾，濾液用標準試管收集，染色緩沖液為提取緩沖液內加入3000ml/L的RNA酶A和10ml/L EB（溴化乙錠），通過流式細胞分析儀的激發光源照射可激發經熒光染色的DNA分子促發熒光，測定裝置測定熒光強度，與測定裝置相連的計算機分析軟件即可對熒光強度進行分析，觀察細胞核DNA含量明顯增加的情況。隨著植物倍性水平的增高，細胞核DNA含量明顯增加。

5.4 根尖染色體測定

針對三倍體月季的倍性測定，還可以通過根尖染色體制片來進行染色體數量測定，以確定雜交種倍性。

5.4.1 測定材料選取

選擇雜交種植株的莖段，利用組織培養技術進行接種培養，直至生根。上午8～9點時，截取生長狀態良好的組培苗的根尖，長約2cm。

5.4.2 預處理

將切下的根尖清洗后放入0.002mol/L、8-羥基喹啉溶液中，在室溫下浸泡45min，抑制紡錘絲的形成。

5.4.3 固定

將根尖取出后，用蒸餾水清洗三遍，投入到卡諾固定液中，放置到4℃冰箱中固定1h，迅速殺死細胞。

5.4.4 解離

將固定之后的根尖清洗3次，投放到5mol/L HCL中，在室溫下浸泡10min，使細胞壁軟化，易于壓片。

5.4.5 染色

將根尖取出，蒸餾水清洗3次，投入到卡寶品紅溶液中2～3h，進行染色。

5.4.6 壓片

使用雙面刀片切去根尖部分，長度約1mm，放置在載玻片上，滴加清水，將蓋玻片一側接觸水滴，輕輕蓋上蓋玻片，用濾紙吸去多余水分。在載玻片下墊上濾紙，使用鑷子輕微敲擊蓋玻片，使根尖細胞分散開。

5.4.7 鏡檢

將根尖壓片制好后，放在顯微鏡下觀察染色體數，以確定被測雜交種的倍性。

6 結語

月季的育種方法很多，隨著時間發展，技術進步，我國自育的月季新品種越來越多，培育新品種月季的方法也越來越多，而通過常規雜交育種，培育三倍體月季的研究不多，但是已經有培育成功的報道，這足以證明這種月季三倍體育種方法可行，而且這種培育三倍體月季的方法也是月季育種中不可或缺的。

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