放射性視神經(jīng)病變相關(guān)microRNA篩選及其應(yīng)用價(jià)值

張麗娜，吳伯樂(lè)，黃武，倪麗莎，胡夏云

放射性視神經(jīng)病變（RION）是頭頸部腫瘤放射治療后的嚴(yán)重并發(fā)癥，可導(dǎo)致完全失明的一種放射性損傷[1-2]。已有研究報(bào)道，在視網(wǎng)膜尤其是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，microRNAs存在差異表達(dá)并具有組織特異性特點(diǎn)[3]，這些差異表現(xiàn)出明顯相關(guān)性。近期有研究報(bào)道放射損傷可導(dǎo)致組織細(xì)胞microRNAs表達(dá)譜發(fā)生改變[4]，如Templin等[5]對(duì)部分接受1.25 Gy X射線照射后的人群進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，照射后外周血中有45種microRNAs表達(dá)水平明顯上調(diào)，并導(dǎo)致相應(yīng)的靶基因表達(dá)水平降低，這表明外周血micro-RNAs差異表達(dá)可作為放射損傷的分子標(biāo)志物。本研究對(duì)RION相關(guān)microRNA進(jìn)行篩選，并探討其臨床診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

圖5 中重度IBD患者治療前腸黏膜組織VEGF-A表達(dá)（免疫組化染色，×200）

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1月至2021年6月浙江省麗水市人民醫(yī)院接受頭頸部放療并發(fā)生RION患者16例（RION組）和同期未發(fā)生RION的頭頸部放療患者16例（對(duì)照組），并選取視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株（RGC-5）（購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）頭頸部腫瘤診斷明確；（2）擬行調(diào)強(qiáng)放療；（3）簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）普通放療者；（2）合并視神經(jīng)病變者；（3）放療前接受過(guò)化療者。RION組男9例，女7例；平均年齡（48.2±14.2）歲；原發(fā)病為鼻咽癌7例，腦腫瘤8例，淋巴瘤1例。對(duì)照組男8例，女8例；平均年齡（46.6±16.6）歲；原發(fā)病為鼻咽癌9例，腦腫瘤7例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 放射損傷模型的構(gòu)建 應(yīng)用直線加速器對(duì)RGC-5細(xì)胞進(jìn)行照射，吸收劑量分別為0、2、4和8 Gy，照射后于不同時(shí)間在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，分析放射損傷后不同時(shí)間點(diǎn)RGC-5細(xì)胞的活性。

1.2.2 Real-time PCR檢測(cè)放射前后microRNA表達(dá)情況 根據(jù)RION相關(guān)差異表達(dá)microRNA分子序列，委托深圳吉瑪基因公司合成相關(guān)的microRNAmimics（模擬分子）和inhibitor（抑制分子），并采用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染，分別上調(diào)和下調(diào)RGC-5細(xì)胞內(nèi)相關(guān)差異microRNA的過(guò)表達(dá)和低表達(dá)。轉(zhuǎn)染后檢測(cè)目標(biāo)microRNA的表達(dá)及對(duì)RGC-5細(xì)胞放射損傷的影響。

1.2.3 標(biāo)本留取 患者于接受放療前及放療后分別留取外周血，并提取總RNA后放置于－80℃冰箱中待檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用STATA8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)；采用貝葉斯定理評(píng)價(jià)RION相關(guān)差異表達(dá)mciroRNA預(yù)測(cè)或早期診斷RION的臨床價(jià)值，并采用受試者工作特征曲線（ROC）進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RGC細(xì)胞系培養(yǎng)及放射模型 照射后4 Gy組和8 Gy組較其他兩組細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生明顯改變（封三彩圖1）；MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著照射時(shí)間的增加，2、4和8 Gy組細(xì)胞存活率較0 Gy組均下降（均P＜0.05），見(jiàn)封三彩圖2。

圖1 倒置顯微鏡下觀察不同劑量X射線照射后細(xì)胞形態(tài)注：A為0 Gy組，B為2 Gy組，C為4 Gy組，D為8 Gy組

圖2 不同劑量組細(xì)胞存活率比較注：*＜0.05

2.2 microRNA差異表達(dá)情況 RGC-5細(xì)胞接受8 Gy照射7 d后，有9個(gè)microRNA表達(dá)水平變化不明顯，而miR-192和miR-34a表達(dá)明顯上調(diào)（F=8.56、11.23，均P＜0.05），見(jiàn)封三彩圖3。

圖3 micorRNA不同放射劑量表達(dá)水平比較注：A為不同劑量組的熱圖；B為不同劑量組microRNA表達(dá)水平變化曲線

2.3 RION組和對(duì)照組miR-192、miR-34a表達(dá)情況RION組和對(duì)照組放療前miR-192分別為0.53±0.22和0.50±0.23，miR-34a分別為0.60±0.31和0.67±0.38，兩組miR-192、miR-34a差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.67、0.58，均P＞0.05），RION組放療后miR-192和miR-34a分別為1.13±0.42和1.16±0.41，均高于對(duì)照組的0.49±0.14和0.61±0.25（t=5.84、4.35，均P＜0.05）。

2.4 miR-192和miR-34a預(yù)測(cè)RION的價(jià)值分析以放療結(jié)束后血清miR-192為參考，預(yù)測(cè)RION的敏感性和特異性分別為93.75%和81.25%，ROC曲線下面積為0.97，截?cái)嘀禐?.73；以放療結(jié)束后血清miR-34a為參考，預(yù)測(cè)RION的敏感性和特異性分別為87.75%和75.00%，ROC曲線下面積為0.88，截?cái)嘀禐?.92。見(jiàn)封三彩圖4。

圖4 miR-192和miR-34a預(yù)測(cè)RION的ROC曲線

3 討論

臨床上通常將RION分為前部視神經(jīng)損傷和后部視神經(jīng)損傷兩種類型。前部視神經(jīng)損傷為急性放射損傷，一般發(fā)生在急性放射暴露或眼眶腫瘤大劑量放療后，表現(xiàn)為視乳頭出血水腫，視網(wǎng)膜管閉塞呈白線狀，多為大劑量電離輻射直接損傷和神經(jīng)所致出血水腫[6]。后部視神經(jīng)損傷具有一定的潛伏期，早期眼底檢查正常，從視神經(jīng)損傷到出現(xiàn)臨床癥狀為放療后數(shù)月甚至數(shù)年，因此又稱遲發(fā)性RION[7-8]。

隨著放療技術(shù)的提高及劑量分割等放療方法的改進(jìn)，急性放射損傷已非常少見(jiàn)，通常所指RION一般多為遲發(fā)性RION。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究證明，視神經(jīng)和視交叉對(duì)放射線敏感性較高，放射線導(dǎo)致視神經(jīng)損傷的機(jī)制包括：（1）電離效應(yīng)；（2）導(dǎo)致微循環(huán)障礙；（3）氧化損傷；（4）細(xì)胞DNA損傷等[9]。這些損傷機(jī)制能夠解釋急性RION的損傷原理和病理特點(diǎn)，而遲發(fā)性RION的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。如何明確遲發(fā)性RION不同階段的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和組織病理學(xué)特點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上揭示其發(fā)病機(jī)制，是實(shí)現(xiàn)RION早期診斷的前提，也是對(duì)RION進(jìn)行有效治療的基礎(chǔ)[10]。RION多為雙眼先后發(fā)病，初期沒(méi)有任何癥狀，待患者視力出現(xiàn)明顯下降時(shí)則神經(jīng)已發(fā)生萎縮。目前臨床上尚缺乏針對(duì)視神經(jīng)萎縮的確切治療方法，因此放射性神經(jīng)損傷預(yù)后極差，給患者帶來(lái)了極大的痛苦。目前多數(shù)學(xué)者已達(dá)成共識(shí)，只有對(duì)早期診斷的RION患者進(jìn)行積極的高壓氧治療，才能挽救并保留部分視力。然而，目前尚沒(méi)有任何一種方法能夠?qū)Ψ派浔┞逗蟮娜巳哼M(jìn)行RION實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，也沒(méi)有任何技術(shù)手段或標(biāo)志物能對(duì)RION進(jìn)行早期診斷。Lee等[11]甚至認(rèn)為，對(duì)于已經(jīng)發(fā)病的RION患者目前任何相關(guān)治療方案都未被證實(shí)有效。如何對(duì)RION進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和早期診斷，以便盡早采取預(yù)防和治療措施，已經(jīng)成為制約RION防治的難題和瓶頸。

圖6 中重度IBD患者治療后腸黏膜組織VEGF-A表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖7 對(duì)照組腸黏膜組織VEGF-A表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖8 血清miR-19b、miR-9及miR-155-5P及聯(lián)合檢測(cè)診斷ESCC的ROC曲線

目前，將microRNAs作為RION分子標(biāo)志物的相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示照射后4和8 Gy組較其他各組細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生明顯改變，這提示視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞對(duì)放射較為敏感，且存在劑量依賴性。隨著照射時(shí)間的增加，2、4和8 Gy組細(xì)胞存活率較0 Gy組有顯著差異（P＜0.05）。同時(shí)本研究證實(shí)miR-192和miR-34a表達(dá)在放射治療后明顯上調(diào)，這提示miR-192和miR-34a可能與RION的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。臨床研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)以放療結(jié)束后血清miR-192為參考，預(yù)測(cè)RION的敏感性和特異性均較高，因此，miR-192和miR-34a可作為預(yù)測(cè)其發(fā)生的血清學(xué)標(biāo)志物。同時(shí)，進(jìn)一步對(duì)miR-192和miR-34a參與RION的分子機(jī)制進(jìn)行研究，有望開(kāi)發(fā)出預(yù)防或治療RION的microRNA靶向藥物。

本研究也存在一定的局限性，首先納入RION患者的例數(shù)較少，導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)效能不高。其次，不同患者接受的放療劑量存在一定差異，這些差異可能是導(dǎo)致RION發(fā)生及microRNA表達(dá)變化的重要原因。因此，后續(xù)應(yīng)加大樣本量，同時(shí)進(jìn)行回歸分析，降低混雜因素對(duì)RION發(fā)生的影響，進(jìn)一步明確microRNA在RION發(fā)生及發(fā)展中的作用及其作為預(yù)測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物的可行性。