GCMS研究胡椒木精油成分變化及生物活性對比*

劉彩英，李儉云，馬玄昊，孫 楠，伍 燕

(興義民族師范學院生物與化學學院，貴州 興義 562400)

胡椒木(ZanthoxylumpiperitumBenn.)為蕓香科Rutaceae花椒屬Zanthoxylum常綠灌木，奇數羽狀復葉，葉面有透明的油點，揉碎后會散發出濃郁的芳香氣味，胡椒木枝葉青翠，樹形優美，是常見的綠籬造型植物[1-2]。胡椒木葉和果實中富含油脂，研究表明主要成分是檸檬烯、肉桂酸甲酯、蒈烯、蒎烯、水芹烯、石竹烯等萜烯類和酯類物質，散發的混合芳香氣味具有抑菌、趨避和殺蟲活性作用[3]，因此在種植胡椒木的周圍環境病蟲害少，可以減少化學農藥的施用，進而減小對土壤和水源的污染[4]。胡椒木還能運輸和吸收土壤中的重金屬，修復被農藥和過度施肥引起的土壤污染[5]。

目前，有研究者在不同季節提取和研究了胡椒木精油中的成分，對胡椒木精油不同季節的次生代謝產物累積和變化趨勢做了研究[6]，但對不同季節提取的精油在活性上的差異未有報道，本研究在此基礎上，采用水蒸氣蒸餾法提取四月份和七月份產出的胡椒木葉和果實，對兩種精油的可揮發性成分采用氣質連用分析次生代謝產物在不同月份的積累和變化，檢測兩種精油對常見病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和肺炎克雷伯菌的抗菌活性差異，對斜紋夜蛾幼蟲的拒食活性及對ABTs、DPPH自由基的抗氧化活性差異，找出引起差異的關聯成分，以便對胡椒木的開發利用有更好的了解。

1 實 驗

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

四月份采摘胡椒木的葉和七月份采摘胡椒木的果實。

供試細菌：大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌(本實驗室保存)。

供試昆蟲：斜紋夜蛾卵，購于河南省濟源白云實業有限公司。

1.1.2 試劑和設備

1,1-二苯基-2 -三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，麥克林試劑公司；SW-CJ-2F超凈工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；YXQ-SL-75G高壓蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 精油提取

采用水蒸氣蒸餾法提取，飽和氯化鈉分層后保留上層精油，密封后避光保存。

1.2.2 GC-MS分析條件

色譜條件：用10倍甲醇稀釋精油原液，HP-5彈性石英毛細管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，載氣為高純氦氣，流速為1.5 mL·min-1，分流比50:1，進樣量為1 μL，進樣口溫度280 ℃，程序升溫為柱溫80 ℃，2 ℃·min-1的速率升至250 ℃。

質譜條件：電子轟擊(EI)能量70 eV，離子源溫度220 ℃，接口溫度250 ℃，溶劑延遲2 min，全掃描，質量掃描范圍為50～400 m/z。

定性定量條件：各組分質譜碎片在質譜檢索標準庫NIST 14中進行匹配解析。

1.2.3 精油的抑菌活性實驗

采用對倍稀釋法，參照文獻[7]進行。

1.2.4 精油對斜紋夜蛾幼蟲拒食活性實驗

采用小葉碟法，參照文獻[8]進行。

1.2.5 精油對ABTs、DPPH自由基的清除率實驗

分別稱取適量四月胡椒木精油和七月胡椒木精油原液，用無水乙醇配制成100、80、60、40、20和10 mg/mL不同濃度溶液待用，ABTs自由基清除試驗在734 nm波長處測定吸光度值，參照文獻[9]進行；DPPH·清除試驗在517 nm波長處測吸光度值，參照文獻[10]進行。

2 結果與討論

2.1 不同月份胡椒木果精油總離子流圖

圖1 四月(A)和七月(B)胡椒木精油總離子流程圖Fig.1 Total ion current of volatile flavor components of Zanthoxylum piperitum from April(A) and July(B)

不同季節采摘的胡椒木精油可揮發性成分GC-MS總離子流圖如圖1A和圖1B所示。利用NIST 14譜圖庫自動檢索各組分的質譜數據并人工校對，四月胡椒木精油檢測出30種化合物，七月胡椒木精油檢測出14種化合物，從圖可知，經過3個月的生長和積累后，精油的成分和含量有明顯變化。

2.2 不同月份胡椒木精油可揮發性成分對比

采用峰面積歸一化法得到不同月份胡椒木精油各主要成分的含量如表1所示，四月份胡椒木精油主要以肉桂酸甲酯為主，檸檬烯其次；七月份胡椒木精油萜烯類物質增加，檸檬烯含量增加，其它如蒈烯、石竹烯、蛇麻烯、香橙烯含量均有增加，肉桂酸甲酯含量降低。

表1 不同月份胡椒木揮發油的化學物質組成比較Table 1 Analytical result of volatile components of different months from Zanthoxylum piperitum

續表1

2.3 不同月份胡椒木精油對常見病原菌的抑制活性對比

表2 胡椒木精油的抑菌活性Table 2 The antibacterial activity of essential oils from Zanthoxylum piperitum

由表2可知，兩種精油對4種常見病原菌表現出不同的抑制活性，從結果可知，七月份胡椒木精油對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌的最小抑菌濃度均比四月份胡椒木精油的低，抑制效果好。

2.4 不同月份胡椒木精油對斜紋夜蛾拒食活性比較

從圖2可知，不同濃度的胡椒木精油對斜紋夜蛾均有拒食作用，隨著精油濃度增加對斜紋夜蛾的拒食效果也加強，七月胡椒木精油表現出較強的拒食活性。

圖2 不同濃度胡椒木精油對斜紋夜蛾的拒食率Fig.2 Results of antifeeding rate of essential oils from Zanthoxylum piperitum

2.5 不同月份胡椒木精油的抗氧化活性比較

圖3所示，胡椒木精油對ABTs、DPPH自由基的清除率隨精油濃度的升高有量效關系。精油濃度在10～100 mg/mL范圍內，七月胡椒木精油對ABTs和DPPH的清除作用優于四月胡椒木精油。

圖3 胡椒木精油對ABTs、DPPH自由基的清除率Fig.3 Scavenging effects of the essential oil from Zanthoxylum piperitum on ABTs and DPPH free radicals

3 結 論

胡椒木精油經GC-MS鑒定共有33種有機類物質，主要是萜烯類、酯類、醇類和少量醛、酮等，其中萜烯類化合物17種，酯類化合物5種，醇類化合物7種，胡椒木的特殊芳香味來自這些有機物的混合釋放。胡椒木在不同月份釋放的揮發性成分在種類和含量上存在明顯差異，四月份可鑒定的揮發性成分有30種，而七月份揮發性成分只有14種，成分的累積也發生相應變化，四月份萜烯類物質含量低于酯類物質，七月份萜烯類物質含量高于酯類物質。酯類物質如肉桂酸甲酯四月份含量較高，達到64.06%，七月份減少到38.24%，萜烯類物質如檸檬烯在四月份有19.59%，七月份升高到32.83%，其它的蒈烯、萜品烯、石竹烯、蛇麻烯、水芹烯等烯類含量也有不同程度升高。

胡椒木不同月份次生代謝物在種類和含量上發生變化，表現在抑菌、拒食和抗氧化活性上也不同。七月份提取的精油在抑菌活性上顯示出較強的抑制活性，其最小抑菌濃度MIC值均比四月份提取的精油小；在對斜紋夜蛾幼蟲的拒食活性上，七月份提取的精油拒食效果也比四月份的強；抗氧化實驗表明，七月份胡椒木精油對ABTs和DPPH自由基的清除效果較四月份的好。研究表明，胡椒木精油成分中的檸檬烯可抑制多種病原菌的生長，對昆蟲也具有明顯的趨避和拒食作用[11]，蒈烯對蚊蟲具有毒殺作用，水芹烯、石竹烯、香茅醛、薄荷醇、松油醇等萜烯類和醇醛類物質對病原菌和昆蟲也具有毒殺和趨避活性[12-18]，因此，七月份提取的精油萜烯類成分增多，在抑菌、拒食上較四月份活性高。本研究表明，胡椒木作為美化環境的綠籬植物，樹形優美，可塑性強，釋放的芳香氣體可抑菌、拒食和趨避，對減少農藥施放起到一定作用，尤其是七月份積累的有機物使得藥理活性更高。