基于三苯胺的粘度熒光探針的構建及性質研究*

黃 娜，杜海靈，陳 曦，沈舒婷，王 慧，胡 磊

(皖南醫學院藥學院，安徽 蕪湖 241002)

小分子熒光探針因其具有高的靈敏度、快的反應速度、好的穩定性、強的特異性、操作簡便和結構易修飾等特點，已經被廣泛用于化學傳感、生物醫藥、生物傳感、生物成像等領域[1-3]。近幾十年來，科研工作者們也設計合成了許多小分子熒光探針用于檢測生物體內的生物分子(如金屬離子、活性氧等)和細胞內的微環境(如粘度、極性、pH、溫度等)[4-6]。在諸多被檢測物中，粘度，作為細胞內微環境的一個重要參數，在物質運輸、生物分子相互作用等過程中起著至關重要的作用[7-8]。細胞粘度水平的異常，也與多種疾病密切相關，如腦血栓、動脈硬化、阿爾茲海默癥、惡性腫瘤等[9-10]。因此，開發專一性響應細胞內粘度的小分子熒光探針具有重要的科學意義。

三苯胺及其衍生物因具有較高的給電子性、較高的空穴遷移率、較低的離子化電位和較強的熒光性能與光穩定性等已被廣泛應用于光電材料等領域[11-12]。本文以三苯胺為母體，通過縮合反應等設計合成了一種熒光粘度探針L(圖1)，在分子中引入磺酸鹽以提高分子的生物相容性。研究了探針L的熒光強度隨粘度的變化測試，結果顯示隨著粘度的增加，探針L的熒光強度顯著增強，并將其應用于細胞成像。

圖1 探針L的合成路線圖Fig.1 The synthetic route of probe L

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

儀器：Bruker Avance 400型核磁共振儀(TMS為內標)，德國布魯克；UV-5900PC型紫外光譜儀，上海元析；HITACHI F-4600型熒光光譜儀，日本日立；Infinite 200 pro型酶標儀，瑞士Tecan；Leica TCS SP 8 型共聚焦顯微成像系統，德國徠卡；Nicolet FT-IR-is5型傅里葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)，美國賽默飛；Finnigan LCQ 型質譜儀(ESI源)，美國賽默飛。

試劑：碘苯(98%)，3-甲氧基苯胺(98%)，碘化亞銅(98%)，叔丁醇鉀(98%)，1,10-菲啰啉(99%)，三溴化硼(99.9%)，2-甲基苯并噻唑(98%)，1,3-丙磺酸內酯(99%)，其它試劑和藥品均為分析純，上海阿拉丁試劑有限公司；三氯氧磷(99.5%),安耐吉化學有限公司；實驗用水為超純水。

1.2 探針L的合成

中間體M1和M2的合成見參考文獻[13-14]。在100 mL圓底燒瓶中依次加入M1(0.28 g，1 mmol)、M2(0.27 g，1 mmol)、乙醇(40 mL)和哌啶(100 μL)，回流反應20 h后，減壓除去大部分溶劑，粗產物經硅膠柱層析分離(洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇=50∶1)，得純紫紅色固體。產率：52%。1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) δ: 10.74 (s, 1 H), 8.29～8.23 (m, 2 H), 8.19 (d,J=15.4 Hz, 1 H), 8.02 (d,J=9.0 Hz, 1 H), 7.85 (d,J=15.4 Hz, 1 H), 7.79 (t,J=7.9 Hz, 1 H), 7.69 (t,J=7.8 Hz, 1 H), 7.46 (t,J=7.9 Hz, 4 H), 7.30～7.23 (m, 6 H), 6.34 (m, 2 H), 4.96～4.90 (m, 2 H), 2.62 (t,J=6.4 Hz, 2 H), 2.18～2.12 (m, 2 H). IR (selected bands, cm-1): 3481, 1612, 1571, 1483, 1442, 1382, 1326, 1265, 1232, 1193, 1151, 1115, 1043, 959, 757, 705. ESI-MS: 理論值：542.1334；實驗值：543.1403 [M+1]+。

2 結果與討論

2.1 探針L對粘度的響應性質

首先測試了探針L在PBS緩沖溶液和99%甘油中的紫外可見吸收光譜，如圖2A所示，探針L在PBS緩沖液中紫外的最大吸收峰位于508 nm左右，而在99%的甘油中紫外的最大吸收峰位于540 nm左右，發生了明顯的紅移，造成這一現象的可能原因是在高粘度的溶劑中，分子的扭轉受限。初步判斷探針L可用于粘度測試。

緊接著，研究了探針L在水和甘油不同體積比溶液中的熒光發射性質。如圖2B所示，在514 nm的激發波長下(狹縫寬度均為10 nm，電壓為500 V)，探針L在620 nm處的熒光強度值隨著甘油體積比的增加而逐漸增強。從低粘度的PBS溶液到高粘度的甘油溶液中，整個混合溶液的體系粘度數值從1.03 cp增大至956.00 cp，同時探針L的熒光強度也增強了283倍左右，這種現象可解釋為在低粘度的溶液中，分子中與烯烴雙鍵相連的單鍵可以自由旋轉，分子內的能量主要以非輻射躍遷方式衰減，當體系粘度增加時，單鍵的自由旋轉受到限制，這種躍遷方式被削弱，從而導致熒光增強[15]。根據福特斯-霍夫曼方程[16]對探針L在620 nm處熒光強度的對數與粘度對數之間進行了線性擬合，如圖2C所示，從圖中可以看出，探針L的熒光強度比值(logI)與粘度對數(log(viscosity))之間的線性相關性為0.9923，線性回歸方程為logI=0.82 log(viscosity)+1.62，因此，我們可以利用此方程先測得待測溶液的熒光強度數值，將數據帶入方程，即可求得待測溶液的粘度數值。由于探針L的最大發射峰屬于紅光發射區域(λem=620 nm)，可消除細胞內藍綠區自發熒光的干擾，提高信噪比，有望用于生物體系測試。

圖2 探針L在PBS和99%甘油中的紫外可見吸收光譜圖(A)；探針L在PBS和甘油不同體積分數的溶液中的熒光發射光譜 (λex=514 nm)(B)；探針L熒光強度的對數與溶劑粘度對數之間的線性關系(C)；探針L在不同分析物中的熒光強度之比(D)Fig.2 UV-vis absorption spectra of probeL in PBS and 99% glycerol, respectively(A); Fluorescence spectra of L in solutions with different volume fractions of PBS and glycerol(λex=514 nm)(B); Linear relationship between logI and logviscosity(C); Ration of fluorescence intensity of probe L in different analytes(D)

在進行生物測試之前，探索了細胞內的多種物質(如活性氧、氨基酸、生物大分子)對探針L熒光強度的影響。實驗結果見圖2D，探針L只有在99%的甘油體系中熒光強度最強，而其他分析物的加入基本不會影響探針的熒光強度，說明探針L在復雜的生物體系中表現處對粘度的專一性。

2.2 細胞毒性與成像實驗

細胞毒性測試可檢測探針對細胞的毒性大小，只有具有較低細胞毒性的探針才可以安全地用于細胞成像中。采用MTT方法對探針L的細胞存活率進行了測試，以人肝癌細胞(HepG2)為模型，將不同濃度的探針與HepG2細胞共培養24 h，按照文獻的方法處理后[17]，測試了在490 nm處各個孔的吸光度值，根據公式計算得出細胞的存活率，如圖3所示，當探針L的濃度達到25 μM時，細胞存活率仍在80%以上，說明探針L具有較低的細胞毒性，可用于細胞成像中。

圖3 探針L與HepG2細胞共同孵育24 h后的細胞毒性測試Fig.3 Cytotoxicity test of probeL incubated with HepG2 cells for 24 h

在細胞成像實驗中，設計如下兩組實驗：一組是將濃度為10 μM的探針L與HepG2細胞共培養30 min后，用PBS洗滌兩遍；另一組是先用制霉菌素(nystatin)處理細胞1 h，然后加入探針L溶液繼續與細胞共培養30 min，用PBS洗滌兩遍，用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，實驗結果如圖4所示，細胞未用制霉菌素處理前，探針L在HepG2細胞中僅顯示處微弱的熒光，但用制霉菌素處理細胞后，探針L在細胞內的熒光強度增強，是由于制霉菌素可誘導細胞結構發生變化或腫脹，導致細胞內粘度增加[18]。以上結果表明探針L可作為粘度探針用于細胞成像。

圖4 探針L在對細胞用制霉菌素處理前后的細胞 顯影圖(標尺20 μm)Fig.4 Fluorescence images of HepG2 cells incubated with probeL before and after treatment with nystatin(Bar=20 μm)

進一步探索了探針L在生物組織成像中的應用，選取小鼠的大腦組織作為模型，冷凍切片成厚度為20 μm的切片。向大腦組織中加入PBS溶液培養，然后探針L(10 μM)溶液，在37 ℃恒溫培養箱中培養30 min，用PBS洗滌3遍后，將組織固定在載玻片上，直接用于共聚焦成像測試。如圖5所示，探針L能夠很好的著色小鼠的大腦組織，且滲透深度達到15.96 μm，說明探針L有較好的組織穿透力，可用于組織成像。

圖5 探針L與小鼠大腦組織共培養后的組織成像圖(A)； 小鼠大腦組織的滲透深度圖(B)(標尺為100 μm)Fig.5 Cofocal images of a mouse brain tissue incubated withL(A); The depth of tissue penetration (B)(Bar=100 μm)

3 結 論

以三苯胺為母體，設計合成了一種新型的粘度熒光探針L，系統研究了探針L對粘度的響應性質及其他分析物的干擾性質，結果表明，隨著粘度的增加，探針L在620 nm處的熒光強度增強約283倍，且不受生物體內其他分析物的干擾。生物實驗結果表明，探針L具有較高的細胞存活率，可用于檢測用制霉菌素處理細胞后的粘度變化；在組織成像中，探針L表現出較深的組織滲透能力。該研究結果為后期設計具有較好生物相容性的粘度熒光探針提高了實驗基礎。