UPLC-MS/MS聯用技術測定厄貝沙坦中N-亞硝基二甲胺與N-亞硝基二乙胺

陳可心，高 珣，李軍毅，李輝輝，劉欽偉，閆占寬

(1 江蘇海洋大學，江蘇 連云港 222005；2 江蘇原創藥物研發有限公司，江蘇 連云港 222042)

高血壓是心腦血管疾病最主要的危險因素，也是我國最常見、最具普遍性和代表性的慢性病之一，其治療往往伴隨著終身服藥。血管緊張素Ⅱ受體阻斷藥(ARBs)又稱沙坦類藥物，是目前常用的高血壓一線藥。研究表明此類藥物除具降壓機制外還具有心血管保護[1-4]、腎臟保護[5-7]、降低2型糖尿病發病風險[8-10]等靶器官保護作用，不良反應極少，患者耐受性好[11]。2018年，浙江華海纈沙坦原料藥中檢出了NDMA和NDEA引發了多種纈沙坦藥品召回。隨后，印度Hetero Labs公司生產的氯沙坦和Aurobindo Pharma公司生產的厄貝沙坦中也檢出了超過限度的NDEA基因毒性雜質。由于“纈沙坦事件”的發酵，歐盟[12]將審查范圍擴展至所有沙坦類藥物及其原料藥，美國食品藥品監督管理局(FDA)發布安全警告，多批次問題產品均被召回[13-14]，針對此類基因毒性雜質更明確的檢驗檢測標準陸續頒布。

2020年，歐洲藥典委員會(EDQM)與人用藥品委員會(CHMP)共同決定給制造沙坦類物質的公司一個過渡期。過渡期內，采用現行國際標準設定限量，審查制造工藝并進行必要的更改，以避免亞硝胺雜質的產生。過渡期之后，實施“無亞硝胺”概念，即亞硝胺類雜質需<0.03 μg/g(此限度于2021年4月實施)[15]。亞硝胺雜質中的NDMA和NDEA都屬于ICH M7通則中[16]第一類已知誘變性和致癌性的物質，其分子量小，含量極微，控制限度比較低，因此對檢測方法的靈敏度提出了很高的要求。目前國家藥典委員會(ChPC)、FDA、EDQM及法國國家藥品和保健品安全署(ANSM)等機構公布的NDMA、NDEA檢測方法主要有GC-MS、GC-MS/MS、LC、LC-HRMS、LC-MS/MS法[17-22]等。本研究以0.03 μg/g為雜質限度，采用液相色譜聯用質譜技術，建立了一種同時檢測厄貝沙坦原料藥中兩種基因毒性雜質的方法，以期為評估沙坦類藥物中亞硝胺類雜質風險提供新的方法參考。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

UPLC-Q Exactive Focus二維超高效液相色譜高分辨質譜聯用儀(含Ultimate 3000高效液相色譜儀、Q Exactive Focus質譜儀、電噴霧離子化接口)，賽默飛世爾科技有限公司Thermo Fisher Scientific；QE Focus Tune軟件和Xcalibur分析軟件；MSA225P-1CE-DI十萬分之一電子天平，德國賽多利斯 Sartorius；Milli-Q Advantage A10純水儀，德國默克密理博Merck Millipore；艾本德5430高速離心機，艾本德Eppendorf；KQ-500VDE雙頻超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；移液槍(Research Plus 100～1000 μL)，艾本德Eppendorf；移液槍(Research Plus 1000～5000 μL)，艾本德Eppendorf；Aglient ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)，安捷倫Aglient。

厄貝沙坦(規格：原料藥)，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；N-亞硝基二甲胺(含量99.7%)，中國食品藥品檢定研究院；N-亞硝基二乙胺(含量99.7%)，中國食品藥品檢定研究院；甲醇(Gradient grade for liquid chromatography)，默克MERCK；甲酸(LC-MS)，Fisher Scientific；去離子水，公司自制。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18，3.0 mm×100 mm，1.8 μm；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣體積：40 μL；流動相A為體積分數0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫程序：0～3 min 5%B，3～8 min 5%B→60%B，8～9 min 60%B→95%B，9～12 min 95%B，12～16 min 95%B→5%B，16～20 min 5%B。

1.2.2 質譜條件

離子源類型：大氣壓化學電離源(APCI)，鞘氣流速55 psi，輔助氣流速20 psi，電暈放電電流4.00 μA，離子傳輸管溫度在300 ℃，S-lens電壓50 V，蒸發溫度400 ℃。采集方式：正離子平行反應監測(PRM)模式，PRM方法參數見表1。溶劑進入質譜時間0～10 min，雜質NDMA定性離子(母離子)與定量離子(子離子)的質荷比(m/z)分別為103.0867和75.0560，雜質NDEA定性離子與定量離子均為母離子，質荷比(m/z)為75.0560。

表1 PRM方法Table 1 PRM method

*定量離子。

1.2.3 溶液配制

稀釋液：甲醇:水=5:95。

標準溶液對照品溶液：精密稱取NDMA及NDEA對照品適量，置于同一100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含3.75 μg的對照品貯備液A。再進一步用稀釋液定量稀釋制成75 ng/mL對照品貯備液B和0.75 ng/mL對照品溶液。系列濃度線性溶液：取對照品溶液適量，用稀釋液定量稀釋制成濃度為0.225 ng/mL、0.375 ng/mL的線性1、2溶液。對照品溶液作線性3溶液。取對照品貯備液B適量，用稀釋液定量稀釋制成濃度為1.125 ng/mL、1.5 ng/mL的線性4、5溶液。系列回收率貯備液：取對照品貯備液A適量，以甲醇為稀釋劑，分別稀釋制成濃度約0.225 ng/mL、0.75 ng/mL、1.125 ng/mL的30%、100%、150%回收率貯備液。

供試品溶液精密稱取厄貝沙坦原料藥約250 mg，置50 mL離心管中，精密加入甲醇0.5 mL，超聲2 min，再精密加入超純水9.5 mL，搖勻，超聲振搖5 min，再用離心機以3000 r/min，離心10 min，用0.22 μm 尼龍膜過濾，取續濾液作供試品溶液。

2 結 果

2.1 專屬性試驗

精密稱取厄貝沙坦原料藥約250 mg，按“1.2.3”項方法，加100%回收率貯備液配制100%供試品加標溶液。分別進樣空白溶液、供試品溶液、對照品溶液、100%供試品加標溶液，結果見圖1。NDMA和NDEA的出峰位置分別在2.10 min和8.10 min。確定在所建立的操作條件下，空白溶液和供試品溶液對NDMA和NDEA測定無干擾。

圖1 UPLC-MS/MS色譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS Chromatograms

2.2 線性和范圍

取“1.2.3”項下系列濃度線性溶液1～5各進樣3次，以NDMA和NDEA的濃度(x)為橫坐標，峰面積平均值(y)為縱坐標，進行線性回歸，得NDMA的線性回歸方程為y=2000000x+22342(r=0.9999)，NDEA的線性回歸方程為y=219621x+1669.1(r=0.9999)。表明在測定范圍內，NDMA和NDEA的峰面積與濃度成良好的線性。

2.3 檢測限與定量限

采用直觀法測定NDMA和NDEA的定量限，NDMA和NDEA30%限度即為定量限，信噪比法測定NDMA和NDEA的檢測限，稀釋對照品溶液至一定濃度，信噪比(S/N)為2～4的溶液為檢測限溶液。結果顯示(數據見表2)，NDMA和NDEA檢測限為0.022 ng/mL(0.0009 μg/g)、0.044 ng/mL(0.0018 μg/g)，相對標準偏差(RSD)為2.2%、2.9%，定量限為0.225 ng/mL(0.009 μg/g)、0.229 ng/mL(0.009 μg/g)，均遠低于限度對應的檢測量0.75 ng/mL(0.03 μg/g)。

表2 NDMA和NDEA的定量限與檢測限數據Table 2 LOQ and LOD data of NDMA and NDEA

2.4 精密度和準確度試驗

2.4.1 進樣精密度

取“1.2.3”項下對照品溶液連續進樣6次，計算對照品溶液中NDMA和NDEA峰面積的RSD分別為1.5%和3.1%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性

精密量取“1.2.3”項下對照品溶液3 mL于10 mL容量瓶中，用稀釋液定容，搖勻，作為靈敏度溶液(約0.225 ng/mL)。用100%回收率貯備液平行配制6份100%供試品加標溶液。供試品加標溶液中NDMA和NDEA含量的RSD分別為1.8%、2.7%，表明本方法穩定、重復性良好。

2.4.3 準確度

精密稱取供試品250 mg，合12份，按“1.2.3”項操作，制備3個濃度的系列供試品加標溶液和供試品溶液(平行配制3份)。分別進樣對照品溶液、靈敏度溶液、3份供試品溶液、3份30%供試品加標溶液、3份100%供試品加標溶液、3份150%供試品加標溶液。表3結果顯示，供試品加標溶液回收率均在78%～103%，方法準確可靠。

表3 加樣回收率結果Table 3 Results of recovery test

2.4.4 溶液穩定性

選取0、8、16、24、32、40 h的進樣時間點，分別進樣照品溶液、供試品溶液和100%供試品加標溶液。結果見表4，顯示空白溶液、對照品溶液、供試品溶液和100%供試品加標溶液，室溫放置40 h，NDMA、NDEA峰面積的RSD均≤10.0%。表明溶液在40 h內穩定性良好。

2.4.5 耐用性

在正常色譜質譜條件的基礎上，微調檢測方法中各參數的值，按照“1.2.3”項下方法分別配制對照品溶液、靈敏度溶液、100%供試品加標溶液(平行配制2份)，考察結果顯示(表4)，100%供試品加標溶液中NDMA和NDEA含量的RSD均≤10.0%，表明耐用性良好。

表4 耐用性測定結果Table 4 Durability test results

續表4

2.4.6 樣品含量測定

取連續的3批次厄貝沙坦(原料藥)，分別按“1.2.3”項方法配制供試品溶液，按“1.2.1、1.2.2”項操作條件進行含量測定，兩種N-亞硝胺類基因毒性雜質均未檢出，3批次樣品的典型質譜圖見圖2。

圖2 樣品含量測定的典型質譜圖Fig.2 Typical chromatogram for sample content determination

3 討 論

3.1 色譜條件的選擇

2020版藥典[23]液相色譜條件采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，本研究實驗選擇裝填了高性能的微粒C18填料Agilent ZORBAX Eclipse plus C18快速分離色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)。其特殊的 ZORBAX硅膠顆粒(B類)可以降低或消除堿性和強極性化合物的強吸附作用，分析NDMA、NDEA等堿性化合物時可得到卓越的峰形。目前使用液相色譜質譜聯用儀檢測N-亞硝胺類基因毒性雜質的方法多數以甲醇-水作為流動相，添加供給H+的甲酸試劑以促進離子化，選定體積分數0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動相[24-25]。調試洗脫梯度保證良好的專屬性并優化分析時間。

3.2 質譜條件的選擇

大氣壓化學電離源(APCI)，適用于具有一定揮發性，熱穩定，中低極性的化合物離子化，因此離子源選定APCI源。確定APCI源最佳使用流速0.5 mL/min后，在推薦值內對離子傳輸管溫度、蒸發溫度、鞘氣流速、輔助氣流速等參數進行調試。目標物結構中均含有堿性氮原子，選擇正離子PRM模式采集，電暈放電電流設為4 μA，S-lens電壓50 V，根據離子響應強度確定最佳離子源區參數。溶劑進入質譜時間設為0～10 min可有效避免高濃度主藥洗脫液污染質譜，確保分析方法靈敏度。

4 結 論

本研究建立并驗證了檢測厄貝沙坦原料藥中基因毒性雜質NDMA和NDEA含量的UPLC-MS/MS方法。各項結果均滿足《中華人民共和國藥典》2020年版[23]指導原則9101：分析方法驗證指導原則接受標準。運用該方法檢測連續三批次厄貝沙坦原料藥，均未檢出兩種N-亞硝胺類基因毒性雜質。所建立的厄貝沙坦原料藥中兩種N-亞硝胺雜質的檢測方法靈敏、準確、穩定，應用可靠，有助于進一步強化厄貝沙坦原料藥中N-亞硝胺類基因毒性雜質的市場監管，實現藥品“無亞硝胺”，保障藥品質量安全。