理脾復方制劑含藥血清對大鼠下丘腦神經元細胞瘦素、神經肽Y、八肽膽囊收縮素蛋白與基因的影響

劉啟艷， 張力文， 詹偉， 李春， 龐平， 高娜， 彭玉

小兒厭食癥是發生在兒童時期常見的慢性消化系統疾病，臨床以長期厭惡進食，食量減少為主要特征[1]。近年來研究表明，小兒厭食癥的發病機制與胃腸動力紊亂、微量元素缺乏、多種腦腸肽分泌紊亂等有關[2-3]。有學者認為，“腦腸肽-食欲中樞紊亂”是小兒厭食發生發展的重要環節[4]。下丘腦作為食欲調節中樞[5]，其自身表達的腦腸肽對食欲調節作用尤為重要，如瘦素(leptin，LP)、神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)，八肽膽囊收縮素(cholecystokinin-octopetide,CCK-8)等。理脾復方制劑是貴州中醫藥大學第二附屬醫院治療小兒厭食的驗方-運脾散(院內制劑名為運脾顆粒)基礎上研發的實驗用顆粒制劑。前期研究發現，其治療厭食有效率高達93.3%[6]，調節下丘腦及外周血的CCK-8蛋白濃度[7]。基于此，本研究以下丘腦神經元細胞為靶點，開展理脾復方制劑含藥血清對大鼠下丘腦神經元細胞增殖及其分泌的LP、NPY、CCK-8蛋白及基因的調控影響，探討理脾復方制劑治療厭食的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 5只孕20 d左右的SPF級SD大鼠；50只30日齡SPF級SD大鼠雌雄各半，體質量(60±5)g。由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2014-0011。飼養于貴州醫科大學附屬醫院臨床醫學研究中心SPF級小動物實驗中心[SYXK(黔)2015-0005]，每籠5只，雌雄分開，溫度(20±2)℃，濕度45%～65%，12 h明暗交替照明。5只孕20 d左右的SPF級SD大鼠用于原代下丘腦神經元細胞培養。本研究通過貴州中醫藥大學第二附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 理脾復方制劑(方藥組成：蒼術、白術、茯苓、薏苡仁各10 g，山藥、陳皮、枳殼、神曲、甘草各6 g)由貴州中醫藥大學第二附屬醫院中藥房提供，經貴州中醫藥大學中藥鑒定教研室劉曉龍博士鑒定，委托貴州中醫藥大學藥學院劉文教授參照陳大業方法[8]制備理脾復方制劑顆粒，其含量為2.70 g/kg，供試品樣品按干燥品計算，含柚皮苷(C27H32O11)應不得少于0.98 mg/g，含橙皮苷(C28H34O13)不得少于0.52 mg/g；硫酸鋅口服液(浙江迪耳藥業有限公司)；DMEM/F1(美國Hyclone公司，貨號：SH30023.01)；Neurobasal-A(美國Gibco公司，貨號：10888-022)；B-27無血清補充劑(美國Gibco公司，貨號：17504044)；GAPDH(兔)(bioswamp公司，貨號：PAB36264)；Goat Anti-Rabbit(bioswamp公司，貨號：PAB160011)、磷酸鹽緩沖液(bioswamp公司，貨號：PAB180003)；TritonX-100(bioswamp公司，貨號：PAB180024)；Alexa Fluor 594-cnjugated Goat Anti-Rabbit(bioswamp公司，貨號：PAB160018)；0.25%胰蛋白酶(bioswamp公司，貨號：PAB180002)、青-鏈霉素-兩性霉素B溶液(三抗)(bioswamp公司，貨號：PAB180056)；木瓜蛋白酶(bioswamp公司，貨號：PAB180072)、Rat CCK-8 ELISA試劑盒(bioswamp公司，貨號：RA20802)；Rat Leptin ELISA試劑盒(bioswamp公司，貨號：RA20489)；Rat NPY ELISA試劑盒(bioswamp公司，貨號：RA20022)；MAP2(兔)(美國abcam，貨號：ab183830)；NPY一抗(兔)(美國abcam，貨號：ab180809)；LP一抗(兔)(美國abcam，貨號：ab117751)；CCK-8一抗(兔)(美國Invitrogen，貨號：PA5-75438)。逆轉錄試劑盒(日本TAKARA，貨號：639505)；SYBR Green PCR試劑盒(美國KAPABiosystems，貨號：KM4101)。

1.3 主要儀器 SW-CJ-1D電泳儀(蘇州智凈凈化設備有限公司)；311CO2恒溫培養箱(美國Thermo公司)；DMIL LED倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；C2激光共聚焦(日本Nikon公司)；352型酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS公司)；AC-8洗板機(芬蘭Thermo Labsystems公司)；Tanon-5200全自動化學發光分析儀(上海天能)；mini protean 3 cell電泳儀(美國Bio-Rad公司)；CFX-Connect 96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；JY045-3C凝膠成像系統(北京君意華鑫科技有限公司)。

1.4 實驗分組與處理

1.4.1 動物分組 50只幼齡大鼠按隨機數字表法分為對照組，低、中、高劑量理脾復方制劑組，硫酸鋅組，每組10只。對照組灌胃給予等體積飲用水；硫酸鋅組灌胃給予20 mg/kg硫酸鋅口服溶液；低、中、高劑量理脾復方制劑組分別灌胃給予2.4、4.8和9.8 g/kg理脾復方制劑，各組每日灌胃1次，連續7 d，末次灌胃后1～2 h后予2%戊巴比妥鈉3 mL/kg，腹腔麻醉后股動脈采血，各組血液靜置2 h后，以2 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)后無菌分離血清，0.22 μm過濾器進行過濾，置于-20 ℃冰箱保存備用。使用時室溫恢復并采用DMEM/F12培養基稀釋成10%濃度。

1.4.2 下丘腦神經元細胞原代培養 取孕20 d的SPF級大鼠5只，麻醉后處死，取出胎鼠全腦，于體視顯微鏡下用彎頭鑷剝離軟腦膜及血絲，仔細剔除殘留的腦膜和血管，取出下丘腦至另一含DMEM/F12的EP管內將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加入木瓜蛋白酶2 g/L，37 ℃消化20 min，5 min搖晃1次，加入等體積的DMEM/F12培養基輕輕吹散組織，靜置2 min，取上層單個懸浮細胞，移至一新EP管中；沉淀的細胞團塊加等體積的新鮮培養液，重復上述步驟，將收集的細胞懸液過200目孔徑不銹鋼網除去未消化組織，離心3次，每次以1 000 r/min離心10 min；將收集的細胞用含2% B-27的DMEM/F12重懸，調整細胞濃度，分別用96孔板與6孔板培養，接種密度為7×105個/孔，置于CO2培養箱中培養，4 h后加入無血清的DMEM/F12清洗，維持培養基(45 mL Neurobasal-A+5 mL B27+1%三抗)，每3 d半量換液。

1.4.3 下丘腦神經元細胞鑒定 將神經元細胞消化成單個細胞，接種到對應的孔板的爬片中，37 ℃，5%CO2培養過夜；取出培養皿，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗2次，每次2 mL；加入4%多聚甲醛室溫固定30 min；磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次3 min；0.5%Triton X-100室溫通透20 min，洗滌3次，每次3 min；用5%牛血清白蛋白封閉1 h；吸去皿中的洗滌液，用鑷子取出蓋玻片，有細胞的一面朝上，放在吸水紙上；加1∶300的MAP2一抗稀釋液后置濕盒內，室溫孵育1 h；磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次5 min；加1∶200的Alexa Fluor 594-cnjugated Goat Anti-Rabbit稀釋液37 ℃孵育1 h后，磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次3 min；取干凈的載玻片一塊，作上標記，滴15～20 μL抗熒光淬滅封片液，含4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，用鑷子取出蓋玻片，邊緣搭在紙巾上吸去多余液體，細胞面朝下，貼在載玻片上，熒光倒置顯微鏡觀察。

1.4.4 細胞分組及給藥 采用CCK-8法篩選對照組、理脾復方制組(低、中、高劑量組)，硫酸鋅組在0、2、4、6、8、12、24、36、48 h對下丘腦神經元活性的影響，發現在24 h后，各含藥血清組對下丘腦神經元細胞活性開始增強并具有區別性。故此，將培養成熟的下丘腦細胞消化后重新接種于96孔板中，分為對照、理脾復方制劑(低、中、高劑量)、硫酸鋅組共6組，用相應10%含藥血清培養下丘腦神經元細胞24 h后用于后續相關實驗。

1.4.5 ELISA法檢測下丘腦神經元細胞上清液中LP、NPY、CCK-8含量 10%含藥血清培養下丘腦神經元細胞24 h后收集每組細胞上清液，按LP、NPY、CCK-8的ELISA試劑盒說明書操作進行。

1.4.6 Western Blot法檢測下丘腦神經元細胞LP、NPY、CCK-8蛋白相對表達量 10%含藥血清培養下丘腦神經元細胞24 h后收集每組細胞，加入適量裂解液，勻漿器直至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃ 12 000g離心15 min，取上清，95 ℃以上加熱10 min，12 000g離心10 min，取上清，按二鋅可寧酸蛋白定量試劑盒使用說明書進行定量，每孔上樣20 μg，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，采用濕轉法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h或過夜，先后加入的一抗LP(1∶1 000)、CCK-8(1∶100)、NPY(1∶1 000)，室溫緩慢搖晃1 h或4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的1∶10 000二抗(羊抗兔)，室溫緩慢搖晃1 h后4 ℃孵育過夜，將膜放置于暗室中，取電化學發光液A和B等量混勻，全自動化學發光分析儀中進行檢測，比較目的條帶相對灰度值計算出目的蛋白相對表達量。

1.4.7 實時熒光定量PCR法檢測下丘腦神經元細胞LP、NPY、CCK-8基因相對表達量 Trizol法提取各組下丘腦神經元細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度級濃度。逆轉錄反應條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，16 ℃，-20 ℃保存。合成cDNA模板后采用SYBR Green Ⅰ相對定量分析，選GAPDH作為內參基因。完成反轉錄反應體系和cDNA擴增反應體系，反應條件:95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，39個循環，65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。以GAPDH為內參，用2-ΔΔCT法計算樣品中基因相對表達量。各組大鼠LP、NPY、CCK-8基因基因表達量(△Ct值)，△Ct=目的基因Ct-內參照基因Ct。引物LP由武漢華聯科生物技術有限公司制作，NPY、CCK-8由武漢擎科創新生物技術有限公司制作。具體引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 結果

2.1 下丘腦神經元細胞anti-MAP2免疫熒光法鑒定 圖1結果顯示，下丘腦神經元細胞經染色后，黃色光激發微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)標記的神經元細胞呈紅色熒光，紫外光激發DAPI標記的細胞核呈藍色熒光，兩者融合后即為神經元細胞。

圖1 anti-MAP2免疫熒光染色鑒定下丘腦神經元細胞(×200)

2.2 理脾復方制劑含藥血清對下丘腦神經元細胞上清液LP、NPY、CCK-8蛋白含量的影響 表2結果顯示，與對照組比較，低、中、高劑量理脾復方制劑組和硫酸鋅組下丘腦神經元細胞上清液中LP、NPY、CCK-8蛋白含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 理脾復方制劑含藥血清對下丘腦神經元細胞上清液LP、NPY、CCK-8蛋白含量的影響

2.3 理脾復方制劑含藥血清對下丘腦神經元細胞LP、NPY、CCK-8蛋白相對表達量的影響 表3結果顯示，與對照組比較，中、高劑量理脾復方制劑組和硫酸鋅組下丘腦神經元細胞中LP、NPY、CCK-8蛋白相對表達量降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。但中、高劑量理脾復方制劑組下丘腦神經元細胞對LP、NPY蛋白相對表達量的影響差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 理脾復方制劑含藥血清對下丘腦神經元細胞LP、NPY、CCK-8蛋白相對表達量的影響

2.4 理脾復方制劑含藥血清對下丘腦神經元細胞LP、NPY、CCK-8基因相對表達量的影響 表4結果顯示，與對照組比較，高劑量理脾復方制劑組和硫酸鋅組下丘腦神經元細胞中LP基因相對表達量降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；低、中、高劑量理脾復方制劑組和硫酸鋅組下丘腦神經元細胞中NPY、CCK-8基因相對表達量降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。理脾復方制劑高劑量組對LP、NPY、CCK-8基因相對表達量差異具有統計學意義(P<0.05)。

表4 理脾復方制劑含藥血清對下丘腦神經元細胞LP、NPY、CCK-8基因相對表達量的影響

3 討論

小兒厭食癥，臨床以較長時期厭惡進食，食量減少為特征，各年齡兒童均可發病，以1～6歲多見[9]，但國外有報道為6月齡至3歲兒童[10]。其發病主要由飲食不節、喂養不當所致，這與父母予過多肥甘厚味或過分溺愛、任其恣食生冷等密切相關[11]。我國學齡前兒童厭食癥發病率為12%～34%，每年有遞增趨勢[12]，常見于城市兒童[4]。若本病治療不及時，可影響兒童生長發育，輕者發生疳證(營養不良)，重者并發佝僂病以及貧血等[13]。因此，小兒厭食癥仍是中西醫兒科醫生共同關注及防治的疾病之一。

理脾復方制劑為“四君子湯”和“平胃散”兩方化裁而成，君藥蒼術微苦，氣味芳香而悅胃，善燥濕健脾；白術氣清香悅胃，其性甘溫補脾家之元氣，善補氣以復脾運，兩藥配伍使用，加強脾運之功。山藥、白術共為臣藥，既可補益脾氣養胃，增強脾胃運化能力，又能生津以濡養臟腑經絡。陳皮性溫燥而健脾，善燥濕和中；枳殼苦辛，善治飲食積滯；茯苓性平，補而不峻，利而不猛，為滲濕要藥；薏苡仁滲濕健脾；神曲性甘溫味辛以行散消食、健脾開胃；炙甘草為使藥，以調和諸藥。全方旨在“理順脾胃氣機轉樞，恢復胃納脾運”作用。課題組前期對該方機制研究結果發現，理脾復方制劑除對胃腸推進率有促進作用外[14]，還對食欲中樞下丘腦組織中CCK-8蛋白含量具有調節作用[7]。由此可見，理脾復方制劑發揮治療作用的機制不僅與消化系統臟腑組織有關，也對中樞神經系統有關。

食欲調節機制包括下丘腦和腦干機制、甜味或氨基酸的味覺感受器(鮮味)、腸道肽能和激素對進食和飽腹反應的控制[15]。下丘腦位于大腦的內側基底區域，感知并整合來自血管和第三腦室的各種信號(如葡萄糖和激素的水平)，從而調節食物攝入[16]。下丘腦神經元包括具有抑制食欲功能的阿片-促黑素細胞皮質素原(pro-opiomelanocortin，POMC)神經元和促進食欲的NPY/阿片-促黑素細胞皮質素原刺鼠相關蛋白肽(agouti-related peptide，AGRP)神經元，其中POMC神經元釋放的α-促黑激素是重要的食欲抑制因子，受LP等激素水平調節[17]。由此可推測，理脾復方制劑發揮治療厭食的作用機制可能與下丘腦神經元中NPY、LP等有關。

NPY由36個氨基酸組成的活性單鏈多肽，由于結構中富含酪氨酸，故稱為神經肽酪氨酸，“Y”指的就是分子兩端的酪氨酸殘基。NPY受體屬于G蛋白耦聯受體，目前發現的NPY受體有Y1R、Y2R、Y3R、Y4R、Y5R，其中Y1R、Y2R、Y5R與攝食密切相關[18-19]。在中樞神經系統中，弓狀核表達最為豐富，是大腦中發現的最有效的食欲肽之一[20]。LP(源于希臘語“leptos”，意思是“瘦”)來源于位于7號染色體上的lep基因，是一種主要由脂肪細胞產生的16 kda多肽，乳腺、卵巢、骨骼肌、胃、腦下垂體和淋巴組織可能產生少量的LP。LP在調節食物攝入方面起關鍵作用，無論是外周還是中樞注射LP，都能顯著抑制ob/ob大鼠食物攝入[21]。在中樞系統中，LP靶神經元分布于下丘腦的各個區域，包括弓狀核、腹側乳頭前核、內側視前核、背內側核、腹內側、室旁下丘腦核、外側下丘腦區[22]。血液中的LP可通過血腦屏障，直接與大腦溝通[23]。可溶性LP受體在POMC和NPY/AGRP神經元上均有表達，以弓狀核表達最高[5]，LP通過可溶性LP受體刺激POMC神經肽合成并產生α-促黑激素，發揮抑制食欲與減少體質量作用。CCK由115個CCK氨基酸前體衍生而來，包括CCK-58、CCK-39、CCK-33、CCK-22、硫酸化的CCK-8和CCK-7、非硫酸化的CCK-8和CCK-7、CCK-5、CCK-4[24]。CCK在哺乳動物組織中廣泛表達，如下丘腦、腦干等部位，其中以下丘腦表達最為豐富[25]，尤其是CCK-8。本研究結果顯示，理脾復方制劑含藥血清可降低正常大鼠下丘腦神經元細胞中LP、NPY、CCK-8蛋白、基因相對表達量以及其上清液中LP、NPY、CCK-8含量。

綜上所述，理脾復方制劑治療厭食作用機制之一可能通過綜合調節下丘腦神經元中LP、NPY、CCK-8蛋白及基因表達，實現改善厭食相關癥狀，但影響LP、NPY、CCK-8蛋白及基因表達作用與劑量呈負相關性，其中以高劑量作用明顯。