應(yīng)用MALDI-TOF MS快速鑒定blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌

汪華學(xué)，張 杰，曹云松，徐 陽，應(yīng)沖濤，郭 普

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1. 重癥醫(yī)學(xué)科；2. 檢驗科，安徽 蚌埠 233004)

近年來，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbape-nems-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)在臨床的檢出率呈增長趨勢，尤其在重癥醫(yī)學(xué)科，CRKP多為泛耐藥菌株，治療藥物選擇困難，且易引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，給臨床診療及醫(yī)院感染防控帶來巨大的風(fēng)險與挑戰(zhàn)[1-2]?？焖佟?zhǔn)確檢測CRKP對臨床重癥感染患者的快速診斷，及時治療，以及減少醫(yī)院感染風(fēng)險，減少患者住院費用，降低感染患者病死率等具有重要意義。CRKP菌株的檢測常見方法有耐藥表型檢測、免疫學(xué)方法檢測碳青霉烯酶以及分子生物學(xué)方法檢測碳青霉烯酶基因等[3]，但上述方法存在檢測時間長、試驗條件要求高、檢測費用昂貴等不足。基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)通過鑒定微生物的蛋白圖譜，為臨床菌株的快速鑒別提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持[4]。有研究[5-6]表明，MALDI-TOF MS可用于快速鑒別耐藥菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)。CRKP最主要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)生由blaKPC、blaIMP、blaNDM-1、blaVIM和blaOXA-48基因等介導(dǎo)的碳青霉烯酶，其中我國主要的流行株為blaKPC-2型[7]。MALDI-TOF MS快速檢測CRKP的相關(guān)研究較少，大多應(yīng)用BioTyper軟件進(jìn)行圖譜分析[8]。本研究以PCR方法為“金標(biāo)準(zhǔn)”[9]，應(yīng)用MALDI-TOF MS和SARAMIS軟件建立耐藥型和敏感型2種超級圖庫(Super-Spectra)，用于快速鑒定攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2018年9月—2020年11月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床住院患者分離自痰、血、尿及胸腔積液等標(biāo)本的肺炎克雷伯菌，排除同一患者相同部位檢出的重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 8739、大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-1705(blaKPC-2陽性)、ATCC BAA-1706(blaKPC-2陰性)。菌株均保存于該院微生物實驗室。

1.1.2 試劑及儀器 MH平板、哥倫比亞血瓊脂平板購自合肥天達(dá)試劑公司；MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀、48孔靶板及CHCA基質(zhì)液購自法國生物梅里埃公司；基因組DNA提取試劑盒購自北京Tiangen有限公司；美羅培南(10 μg)和亞胺培南(10 μg)藥敏卡片購自英國Oxoid公司；PCR試劑盒購自日本Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與種屬鑒定 采用三區(qū)劃線，接種收集的菌株，在(36±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取單一菌落，應(yīng)用甲酸萃取法[8]進(jìn)行處理，MALDI-TOF MS鑒定菌株，每個菌株兩個靶點，圖譜由自帶的RUO系統(tǒng)比對獲取。

1.2.2 耐藥表型檢測 采用K-B法檢測菌株耐藥性，結(jié)果參照2020版美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI) M100 30th藥敏標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2.3 耐藥基因檢測 從耐藥表型檢測獲得的CRKP菌株中，挑取單一菌落，接種于3 mL液體肉湯培養(yǎng)基中，進(jìn)行過夜培養(yǎng)；將培養(yǎng)菌液參照說明書，應(yīng)用DNA提取試劑盒，從中獲得基因組DNA(OD260/OD280為1.7～1.9)；根據(jù)blaKPC-2基因特異引物(見表1)，對基因組DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行基因測序，結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI) GenBank數(shù)據(jù)庫對比確認(rèn)。

表1 耐藥基因PCR擴(kuò)增引物序列及產(chǎn)物大小

1.2.4 耐藥型和敏感型超級圖庫的建立 選取70株肺炎克雷伯菌，參照1.2.1方法提取檢出blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌菌體蛋白，并進(jìn)行圖譜采集。結(jié)果以置信區(qū)間為衡量標(biāo)準(zhǔn)(置信區(qū)間為75%～99.9%表示結(jié)果可信，<75%表示結(jié)果不可信)。將收集的圖譜保存至一個文件夾中，去除較大差異的圖譜(確認(rèn)Taxonomy>80%),峰的質(zhì)量(datacount)為80～230；選擇質(zhì)譜峰度相同的最特異的峰，確保每種質(zhì)量峰至少80%的菌株擁有，最終保留35～49個峰(目標(biāo)39～41)，與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定權(quán)重，建立攜帶blaKPC基因型肺炎克雷伯菌的Super-Spectra，用于下一步的驗證。碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌(carbapenem-sensitiveKlebsiellapneumoniae, CSKP) Super-Spectra的建立方法同上，激活后用于驗證。

1.2.5 Super-Spectra驗證 根據(jù)1.2.1的方法，選擇除建庫以外的肺炎克雷伯菌，利用MALDI-TOF MS收集圖譜，應(yīng)用新建的Super-Spectra驗證是否耐藥；以K-B法和PCR結(jié)果作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 耐藥表型及基因型分布 共收集295株肺炎克雷伯菌，經(jīng)耐藥表型篩選CRKP 143株和CSKP 152株；CRKP菌株中檢出攜帶碳青霉烯酶基因140株，經(jīng)測序鑒定為攜帶blaKPC-2基因134株，攜帶blaKPC-18基因3株，攜帶blaNDM-1基因2株，攜帶blaIMP基因1株，未鑒定出blaOXA-48基因；其中2株同時檢出blaKPC-2和blaNDM-1基因。質(zhì)控菌株ATCC BAA-1705攜帶blaKPC-2基因。部分菌株P(guān)CR結(jié)果見圖1。

M：2 000 bp DNA Marker；1～6 泳道：CRKP 菌株。

2.2 Super-Spectra結(jié)果

2.2.1 攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌的超級圖庫 以PCR為標(biāo)準(zhǔn)，選取其中攜帶blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌70株，并加入ATCC BAA-1705，共71株CRKP建立Super-Spectra；菌株Taxonomy均>80%，收集最特異的40個特異峰，確定權(quán)重為28，獲得攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌的Super-Spectra，見圖2。

圖2 攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌的Super-Spectra圖譜

2.2.2 CSKP的超級圖庫 選取CSKP 70株，加入ATCC BAA-1706，共71株，確定權(quán)重為28，建立Super-Spectra，圖譜見圖3。

圖3 CSKP Super-Spectra圖譜

2.2.3 Super-Spectra比較 設(shè)置error值<0.05，二者的圖譜重合率為80%，見圖4。比較發(fā)現(xiàn)，4 154.4、8 310.7、10 880.8 m/z是攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌的特征峰，3 579、10 079.3 m/z是CSKP的特征峰。上述5個峰可作為區(qū)分?jǐn)y帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌和CSKP的特征峰。

圖4 攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌和CSKP的Super-Spectra對比圖

2.3 驗證結(jié)果 將除建庫以外的155株肺炎克雷伯菌作為驗證菌株，以K-B法和PCR作為參考標(biāo)準(zhǔn)，驗證攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌和CSKP的Super-Spectra圖庫的準(zhǔn)確性，見表2。攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌準(zhǔn)確率94.52%(69/73)，CSKP準(zhǔn)確率91.46%(75/82)，新建的Super-Spectra鑒定肺炎克雷伯菌是否對碳青霉烯類抗生素耐藥的準(zhǔn)確率為92.90%(144/155)。

表2 Super-Spectra圖庫驗證結(jié)果

3 討論

CRKP是醫(yī)院感染的重要致病菌，感染治療困難，患者病死率高，同時容易在醫(yī)院內(nèi)傳播引起醫(yī)院感染[10]。而檢測CRKP的傳統(tǒng)方法耗時長，分子檢測手段靈敏度和特異度高，但是對試驗環(huán)境以及人員要求較高，且價格昂貴。因此，快速診斷CRKP有利于臨床早期正確選擇抗菌藥物，降低患者病死率，建立一種快速、簡便且價格較低的CRKP檢測方法尤為重要。

MALDI-TOF MS是近年來廣泛應(yīng)用于臨床的快速鑒定病原菌的新方法。研究[11-12]顯示MALDI-TOF MS在快速鑒別病原菌的同時可用于CRKP的檢測，通過檢測菌株與碳青酶烯類抗生素作用一段時間后的水解產(chǎn)物，或者直接檢測菌株的碳青霉烯酶質(zhì)譜特征峰來判斷CRKP。還有研究[13]采用直接靶板微滴生長法評估菌株對碳青酶烯類抗生素的最小抑菌濃度(MIC)值從而鑒別CRKP。其中直接檢測碳青霉烯酶的質(zhì)譜特征峰最為便捷。MALDI-TOF MS快速鑒定微生物主要是BioTyper和SARAMIS兩種主要系統(tǒng)，其中BioTyper檢測CRKP的方法多用于科研[11, 14]，需要通過兩組數(shù)據(jù)的聚類分析和主成分分析，根據(jù)多菌株或多樣本獲得驗證結(jié)果，操作繁瑣，易導(dǎo)致容錯率降低。而本次研究以鑒定單一菌株為目的，適合臨床某一種菌株或亞種的初篩。本研究通過初篩出攜帶blaKPC-2肺炎克雷伯菌，作為建立Super-Spectra圖庫的試驗菌株，能夠鑒定大多數(shù)CRKP，可作為臨床第一步快速篩選耐藥菌株的有效手段。通過采用MALDI-TOF MS RUO系統(tǒng)和SARAMIS軟件，對攜帶blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌和CSKP進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)區(qū)別兩者的特征峰。與常規(guī)鑒定儀相比，通過質(zhì)譜比對特征峰，可在5～10 min內(nèi)快速初篩，具有時間短、高通量、準(zhǔn)確性高、特異性高等優(yōu)點，并且采用單一菌株，彌補(bǔ)了時效長、準(zhǔn)確性低、操作繁瑣等不足，對疾病診療及感染防控具有重要意義。本試驗通過比較攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌和CSKP的超級圖庫，發(fā)現(xiàn)4 154.4、8 310.7、10 880.8 m/z是攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌的特征峰，3 579、10 079.3 m/z是CSKP的特征峰，這5個特征可以作為該院快速篩查肺炎克雷伯菌的有效工具。經(jīng)過臨床菌株的驗證準(zhǔn)確率為92.90%，其中攜帶blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌準(zhǔn)確率為94.52%，CSKP準(zhǔn)確率為91.46%。

研究顯示[9, 15]，不同地區(qū)碳青霉烯酶基因型分布雖有所差異，但是KPC-2型仍是多地區(qū)最常見的碳青霉烯酶。國外研究[16-17]顯示，攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌的特征峰11 109 m/z，位于編碼PKPQIL-p019蛋白的質(zhì)粒上，但該質(zhì)粒僅在研究區(qū)域內(nèi)流行，在其他不攜帶該質(zhì)粒的區(qū)域內(nèi)尚未檢測出該特征峰，表明菌株的遺傳背景不同，其特征峰大多不盡相同。該院近3年檢出的CRKP菌株也以攜帶KPC-2基因型為主，其他常見碳青霉烯酶基因型檢出率均較低，產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶作為CRKP菌株的主要耐藥機(jī)制，且種類較為單一。依據(jù)是否存在4 154.4、8 310.7、10 880.8 m/z三個特征峰，對于本地區(qū)快速篩選攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌具有一定的臨床應(yīng)用價值。試驗通過分析特征峰之間的差異，快速篩選耐藥菌株，進(jìn)行溯源性分析，判斷醫(yī)院內(nèi)或者本地區(qū)是否存在暴發(fā)流行，具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、實用性強(qiáng)等優(yōu)勢，在區(qū)域流行病學(xué)研究中具有一定的應(yīng)用價值。

本研究中有4株肺炎克雷伯菌經(jīng)過質(zhì)譜分析，未獲得鑒定結(jié)果。耐藥表型分析顯示為2株耐藥和2株敏感，2株耐藥菌株經(jīng)質(zhì)譜分析，未出現(xiàn)4 154.4、8 310.7、10 880.8 m/z特征峰，根據(jù)測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2株耐藥菌株同時攜帶blaKPC-2基因和blaNDM-1基因，兩種基因之間可能存在部分干擾，導(dǎo)致編碼蛋白出現(xiàn)不穩(wěn)定性，干擾菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度；除蛋白表達(dá)水平外，MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果受到臨床菌株來源、抗菌藥物選擇壓力、試驗室環(huán)境、操作者操作嫻熟水平及待測菌株活性等因素制約；菌體可能存在不表達(dá)或表達(dá)過度，導(dǎo)致SARAMIS軟件分析菌體的準(zhǔn)確性不高。本次驗證試驗中有2株CRKP，使用質(zhì)譜超級圖庫分析，鑒定為CSKP；5株CSKP鑒定為CRKP?？赡苡捎诨虻倪z傳背景不同，使菌株蛋白表達(dá)存在差異，影響驗證結(jié)果。本次試驗樣本數(shù)量有限，后期需要擴(kuò)大試驗菌株，根據(jù)CRKP的耐藥機(jī)制，豐富CRKP的特征峰，提高驗證的準(zhǔn)確率。

綜上所述，通過嚴(yán)格構(gòu)建攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌和CSKP的超級圖譜庫，建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的初篩方法用于CRKP的鑒定，有助于在區(qū)域流行病學(xué)研究中有效快速鑒定攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌，以降低其流行和暴發(fā)的風(fēng)險。在后續(xù)研究中，可進(jìn)一步擴(kuò)展該區(qū)域的圖譜庫，嚴(yán)格遵循要求，盡可能選取更多具有代表性的圖譜，納入攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌的超級圖譜庫中。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。