宜昌地區結核分枝桿菌北京基因型菌株的鑒定及VNTR分型

李 丹，胡曉紅，徐新娟，杜德兵，吳文艷，王德成，莊 倩，陳志杰，金 柱

(1. 宜昌市第三人民醫院肺病科，湖北 宜昌 443003；2. 三峽大學感染與炎癥損傷研究所，湖北 宜昌 443002；3. 三峽大學醫學院，湖北 宜昌 443002)

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的一種危害嚴重的傳染病，根據世界衛生組織(WHO)最新報道，2020年全球新發結核病病例約1 000萬，我國超過83萬，依然是全球30個結核病高負擔國家之一[1]。在結核分枝桿菌感染與傳播過程中，某些基因型菌株致病性強、傳播速度快且適應性強，容易引起大范圍廣泛傳播和流行，對結核病的流行至關重要。大量數據證實北京基因型菌株是具有相似遺傳背景和高致病性與傳播力的代表，該菌株已在世界多地傳播和流行[2-4]，我國也屢有相關報道[5-11]。北京基因型菌株是結核分枝桿菌家族中傳播迅速和致病性強的一類優勢菌株，由于不同地域結核病的流行病學差異，不同地域來源的北京家族菌株的特征也不盡相同。Supply等根據結核分枝桿菌基因組DNA中特定位點的數目可變串連重復序列技術(variable-number tandem repeat, VNTR)建立的基因型分型方法[12]，經過不斷改進和優化后已廣泛應用于結核病分子流行病學研究[6-8, 10-11, 13-15]。聯合VNTR分型結果、臨床信息及流行病學數據，可將結核病的傳播鏈與分子流行病學研究有機連接，對了解結核病的傳播動態十分有價值。

宜昌位于我國中西部地區，結核病歷年位居地區傳染病報告發病率前三位，已成為威脅本地區人民健康和社會經濟發展的重大公共衛生問題。北京基因型菌株是結核分枝桿菌家族最重要的成員。收集本地區結核分枝桿菌菌株進行鑒定和分型，研究本地區北京基因型菌株的多態性，既能揭示本地區北京基因型菌株的分子流行病學特征，也能認識和預測結核病的發生和傳播模式，最終為建立適宜本地區的結核病監測平臺和制定相應的結核病防控策略提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集2018年1月—2019年12月宜昌地區(含下轄區縣)的結核分枝桿菌菌株，納入標準為痰抗酸染色陽性或痰結核分枝桿菌培養陽性，并根據菌株信息核對患者的流行病學資料、年齡、性別、病史資料等信息[16]，最終獲得具有完整患者信息的菌株共計298株。標準菌株H37Rv購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 藥敏試驗 所有菌株接種羅氏培養基復種后，采用比例法對4種抗結核藥物進行藥敏試驗，培養基內藥物的終濃度分別為：異煙肼(INH)0.2 μg/mL，利福平(RFP)40 μg/mL，乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL，鏈霉素(SM)4 μg/mL。耐藥標準：含藥培養基菌落數/對照培養基菌落數≥1%即為耐藥。

1.3 北京基因型菌株鑒定 所有菌株接種羅氏培養基復種，采用煮沸法提取細菌基因組DNA。按照下述方法操作鑒定菌株是否為北京基因型。第一步設計4條引物(表1中1～4號)，PCR擴增后，凝膠電泳比較產物大小，如果擴增出850 bp和361 bp兩條帶，則說明標本DNA屬于人型結核分枝桿菌，據此篩選出298個標本中人型結核分枝桿菌并進行北京基因型菌株的鑒定。RD105區域缺失是北京基因型菌株所特有，針對RD105區域設計引物進行多重PCR擴增鑒定北京基因型菌株。根據Chen等[17]建立的RD105缺失片段的DTM-PCR檢測方法，設計3條引物序列(表1中5～7號)，PCR擴增后比較電泳產物，如果只能擴增出1 495 bp條帶，則是非北京基因型菌株；如果擴增出786 bp的條帶，該標本則是北京基因型。電泳結束后在紫外凝膠成像分析系統下觀察結果，以國際參考菌株 H37Rv作為對照。

表1 PCR引物序列

1.4 數據分析

1.4.1 分析方法 將所有北京基因型菌株VNTR位點的重復次數輸入https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index網站，獲得VNTR分型結果，各VNTR位點的分辨率和總分辨率用Hunter-Gaston指數表示，計算公式為：

其中，n為總的菌株數，s為獲得的基因型總數，nj為某基因型的菌株數。

1.4.2 成簇結果分析VNTR分型根據文獻[18-20]方法進行優化 VNTR重復單元數目計算公式如下，各VNTR重復單元數目=(PCR產物長度-各VNTR側翼片段長度)/重復單元長度。兩個或兩個以上的北京基因型菌株具有完全相同的VNTR圖譜，既認為是成簇菌株。

1.5 統計學處理分析 應用SPSS 20.0 統計軟件進行分析，計數資料以百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，P≤0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 北京基因型菌株鑒定結果 共獲得298株臨床菌株，其中260株(占87.25%)鑒定為人型結核分枝桿菌，見圖1；DTM-PCR分型結果發現，260株結核分枝桿菌中，140株(53.85%)屬于北京基因型菌株，見圖2。

注：M為DNA Marker，1～10為結核分枝桿菌的標本，電泳檢測出現850、361 bp 兩條帶，說明模板DNA 是人型結核分枝桿菌，只擴增出850 bp條帶的標本4和10則屬于結核分枝桿菌復合群，不是人型結核分枝桿菌。

注：M為DNA Marker，1～10為結核分枝桿菌的標本，電泳檢測出現786 bp條帶的標本，則為北京基因型菌株，而出現1 495 bp的標本為非北京基因型菌株。

2.2 臨床菌株基本信息 分析260株人型結核分枝菌株來源的患者信息，其中162例男性，98 例女性患者；年齡范圍為 14～82歲，平均年齡49歲。<30歲、30～歲、45～歲和>60歲患者分別為24、60、97、79例，各年齡組感染北京基因型菌株的比率分別為9.28%、22.86%、36.43%、31.43%，北京基因型菌株和非北京基因型菌株感染患者性別、年齡以及治療史各組比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表2。

2.3 臨床菌株藥敏試驗結果 對260株人型結核分枝桿菌進行一線抗結核藥藥敏試驗，4種抗結核藥中，總體耐藥率由高至低依次為：INH>RFP>EMB>SM；北京基因型菌株耐藥率 (32.14%) 高于非北京基因型菌株耐藥率(10.83%)，差異有統計學意義(P=0.007)。見表3。

2.4 VNTR基因分型 VNTR-9位點(QUB-11b、QUB-18、QUB-26、MIRU26、MIRU31、MIRU40、Mtub21、Mtub04、VNTR2372)的分辨能力見表4，其中QUB-11b、QUB-18、QUB-26顯示較高的HGI，而VNTR2372顯示較低的HGI，VNTR-9位點的HGI為0.998 5。VNTR-9位點的分型結果顯示，140株北京基因型菌株呈明顯的多態性(見圖3)，根據MIRU-VNTR位點規則，發現有3組成簇菌株，其中一個基因簇包含8株菌株，成簇率為12.15%。

圖3 140株北京基因型菌株聚類分析圖譜

3 討論

結核分枝桿菌北京基因型家族易導致大范圍感染與流行，基因型鑒定和分型相關研究引起了廣泛關注。相較于傳統針對IS6110序列的RFLP和spoligotyping鑒定手段，Chen等[17]建立的DTM-PCR鑒定方法操作簡單。北京基因型家族菌株缺乏RD105區域，而非北京基因型菌株保留有該區域，因此針對RD105區域設計引物進行多重擴增，能獲得不同長度的DNA片段，以區分北京基因型或非北京基因型。該方法簡單、高效，已廣泛應用于北京基因型菌株的鑒定[8-10, 21-25]。本研究對260株人型結核分枝桿菌進行DTM-PCR檢測，發現140株為北京基因型菌株，與丁冰冰等[26]報道武漢地區所選的85株菌株中91.8%(78株)為北京基因型菌株存在一定差異。本研究首次對宜昌地區北京基因型菌株進行鑒定，結果表明北京基因菌株在該地區的感染與發病中占據優勢地位，同時也需要關注非北京基因型菌株相關研究。

北京基因型菌株是耐藥結核病流行的重要原因。本研究結果顯示，北京基因型菌株耐藥率 (32.14%)，與全國的調查結果基本一致(33.10%)，高于非北京基因型菌株耐藥率(10.83%)，結果顯示宜昌地區結核分枝桿菌的耐藥性以北京基因型菌株為主，研究結果對指導本地耐藥結核病的防控具有重大意義。由于結核分枝桿菌受宿主因素和環境因素等多因素影響，關于宜昌地區北京基因型菌株的生物學特征還需進一步探索。

VNTR已廣泛應用于對北京基因型菌株的分型和成簇的研究。Mazars選擇了VNTR-12位點對來自美國的72株結核分枝桿菌進行分型，發現VNTR-12位點的分辨率高于IS6110-RFLP[27]。Supply基于全球結核分枝桿菌菌株信息大量數據，對VNTR-12分型技術進行了改進，推出了VNTR-15及-24位點的分型技術[12]。隨著VNTR-12、15及24位點分型技術的應用，研究者發現這些位點是針對所有來源的菌株，但對北京基因型菌株的識別能力尚有不足。Zhang等[20]針對北京基因型菌株的特點，比較45個用于北京基因型菌株分型的VNTR位點的分辨率，最后推薦VNTR-7和VNTR-16位點可作為北京基因型菌株的分型。后續研究對VNTR-7和VNTR-16位點進一步進行優化，發現VNTR-9位點對結核分枝桿菌北京基因型菌株具有較好的識別能力[18]，目前已得到廣泛應用[28-30]。本研究中發現QUB-11b位點的識別能力最強，且總HGI為0.998 5，說明該方法對本地區北京基因型菌株具有較高的分辨能力。

本研究首次運用DTM-PCR和VNTR-9位點技術對宜昌地區的北京基因型菌株進行鑒定和分型，相對于劉曉俊等[31]采用的VNTR-24位點對2016—2017年宜昌地區收集的367株結核分枝桿菌的分型結果，本研究重點對該地區北京基因型菌株進行了鑒定和分型，結果表明目前本地區的北京基因型菌株仍然處于流行的優勢地位。另外，使用VNTR-24分型方法，位點多、操作繁瑣，且部分位點不適合于本地區菌株的檢測。本研究中采用DTM-PCR和VNTR-9位點對北京基因型菌株具有較高的鑒定和分型能力，操作簡單，節約時間和操作成本，適用于本地區結核分枝桿菌北京基因型菌株的快速鑒定和分型，為宜昌地區北京基因型菌株分子流行病學的研究和結核病防治提供科學依據。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。