阿維巴坦聯合頭孢他啶、氨曲南或美羅培南對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外抗菌活性

于 夢，王玉潔，于清華，胡付品

(1. 青島市市立醫院檢驗科，山東 青島 266000；2. 復旦大學附屬華山醫院抗生素研究所，上海 200040)

碳青霉烯類抗生素能夠有效抵抗革蘭陰性菌感染，并廣泛應用于臨床，導致耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌(carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE)，尤其是肺炎克雷伯菌的分離率呈快速上升趨勢。同時研究[1-2]顯示，CRE感染患者面臨臨床治療失敗率高、病死率高的困境，給臨床有效抗感染治療帶來巨大挑戰。美國疾病控制與預防中心(CDC)在2019年《抗生素耐藥性威脅報告》中指出，CRE是“最緊迫的威脅”之一。以上情況凸顯了新型抗生素在抗病原體感染方面的重要性。產碳青霉烯酶是包括肺炎克雷伯菌在內的腸桿菌目細菌耐碳青霉烯類抗生素的最主要機制，而酶抑制劑在對抗產酶菌株中發揮著重要作用。阿維巴坦作為一種已投入臨床使用的新型β-內酰胺酶抑制劑，其自身雖無抗菌活性[3]，但能長效、可逆的結合A類[包括超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)和KPC酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase)]、C類 (AmpC酶)和部分D類β-內酰胺酶(如OXA-48)[4-6]，以此恢復與之聯合使用的β-內酰胺類抗生素的抗菌活性。本研究探討頭孢他啶/阿維巴坦，氨曲南/阿維巴坦，美羅培南/阿維巴坦對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)的抗菌活性，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集青島市市立醫院2018—2020年臨床分離的CRKP菌株，剔除同一患者重復分離的菌株。

1.2 主要試劑及儀器 包括梅里埃VITEK MS全自動快速微生物質譜檢測儀，梅里埃VITEK 2 Compact全自動藥敏分析儀，TAKARA普通PCR儀[TaKaRa(大連)生物工程有限公司]，美國伯樂Bio-rad PowerPac基礎電泳儀，美國伯樂Bio-Rad GelDoc XR 凝膠成像系統，Premix Tag[翌圣生物科技(上海)有限公司]。頭孢他啶(130484-201806)、氨曲南(130507-201303)、美羅培南(130506-201403)均購于自中國食品藥品檢定研究院，阿維巴坦(20160831-2)由正大天晴藥業集團股份有限公司提供。

1.3 細菌鑒定及藥敏試驗 采用梅里埃VITEK MS質譜儀及梅里埃VITEK 2 Compact全自動藥敏分析儀分別進行菌株鑒定及常規藥敏測定，依照2020年美國臨床實驗室標準協會(CLSI)M100對藥敏結果進行判定，替加環素敏感性判定參考美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)推薦的標準,最低抑菌濃度(MIC)≤2 μg/mL為敏感，MIC≥8 μg/mL為耐藥；氨曲南/阿維巴坦、美羅培南/阿維巴坦藥敏結果判斷分別參照氨曲南及美羅培南折點判定標準。銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌ATCC 25922質控標準菌株均購自國家衛生健康委臨床檢驗中心。采用微量肉湯稀釋法測定頭孢他啶、頭孢他啶/阿維巴坦、氨曲南、氨曲南/阿維巴坦、美羅培南、美羅培南/阿維巴坦的MIC，阿維巴坦固定濃度為4 μg/mL。

1.4 耐藥基因檢測 采用聚合酶鏈反應(PCR)方法檢測所有受試菌5種常見碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM、blaIMP)攜帶情況，陰性菌株首先按照2020年CLSI M100 ESBLs初篩實驗進行表型篩查，若陽性則進行ESBLs耐藥基因檢測，陰性者則進行AmpC酶耐藥基因(blaMOX、blaCIT、blaDHA、blaACC、blaEBC、blaFOX)篩查，PCR引物及產物大小見表1。

表1 碳青霉烯類耐藥基因PCR引物及產物大小

1.5 MIC及最低殺菌濃度(MBC)測定 在96孔板上采用微量肉湯稀釋法對受試菌進行相關抗菌藥物MIC檢測，嚴格按照標準的操作步驟及試驗方法制備受試菌菌懸液、抗菌藥物等。將保存菌株接種于MH營養瓊脂培養16～18 h，取適量單菌落配制成0.5麥氏單位的菌懸液，采用雙倍CAMHB肉湯按照1∶100比例進行稀釋。向96孔藥敏板中加入制備好的抗菌藥物，再將50 μL稀釋后菌懸液依次加入每孔，使頭孢他啶、氨曲南、美羅培南最終濃度范圍為0.06～128 μg/mL，頭孢他啶/阿維巴坦、氨曲南/阿維巴坦、美羅培南/阿維巴坦最終濃度范圍為0.03/4～64/4 μg/mL，同時每孔菌懸液的最終濃度為105CFU/mL。在頭孢他啶/阿維巴坦、氨曲南/阿維巴坦、美羅培南/阿維巴坦受試菌株的MIC基礎上，取100 μL肉眼未見細菌生長孔中的受試菌液均勻涂布于普通營養瓊脂平板，經過夜孵育后計算相應平板菌落數，若該平板上生長的菌落數<0.1%的初始接種菌量，則相應肉湯孔中的藥物濃度為該抗菌藥物對受試菌的MBC。

1.6 統計分析 應用WHONET 5.6分析細菌對抗菌藥物的耐藥率。

2 結果

2.1 一般資料 63株CRKP菌株標本來源于痰28株(44.4%)，血18株(28.6%)，尿11株(17.5%)及其他類型標本6株(9.5%，包括腹腔積液2株，支氣管肺泡灌洗液、膽汁、分泌物、穿刺液各1株)，從男性患者分離株多于女性患者(73.0% VS 27.0%)，老年人分離菌株占69.8%，重癥監護室(ICU)分離菌株占47.6%。見表2。

表2 63株CRKP菌株來源分布情況

2.2 藥敏結果 CRKP菌株對β-內酰胺類抗生素(頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南)，以及β-內酰胺酶抑制劑的復合制劑(阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦)耐藥率均>95%，對喹諾酮類(環丙沙星、左氧氟沙星)以及單環β-內酰胺類藥物氨曲南的耐藥率也>95%，對氨基糖苷類亦呈現出較高的耐藥率(61.9% ～74.6%)，對替加環素耐藥率較低(1.6%)，對頭孢他啶/阿維巴坦、美羅培南/阿維巴坦的耐藥率為3.2%～7.9%，未檢出對氨曲南/阿維巴坦耐藥的菌株。見表3。

表3 CRKP對抗菌藥物的藥敏結果

2.3 耐藥基因檢測結果 63株CRKP菌株中，57株(90.5%)檢出blaKPC-2基因 ，2株(3.2%)檢出blaNDM-1基因，各有1株(1.6%)檢出blaNDM-5、blaIMP-4、blaIMP-69基因，1株CRKP 5種常見碳青霉烯酶基因菌均未檢出，但檢出AmpC酶基因blaDHA。見圖1。

M：DNA Marker；陰：陰性對照；陽：KPC-2基因陽性對照；泳道1、3、5～8：臨床KPC-2基因陽性菌株；泳道4：臨床KPC-2基因陰性菌株。

2.4 MIC和MBC檢測結果 頭孢他啶/阿維巴坦對 57株攜帶blaKPC-2基因的CRKP株菌的 MIC50、MIC90分別為2/4、8/4 μg/mL，阿維巴坦可將頭孢他啶MIC50及MIC90均下降96.9%；氨曲南/阿維巴坦對其MIC50、MIC90分別為0.5/4、2/4 μg/mL，阿維巴坦可將氨曲南MIC50及MIC90分別下降99.8%、99.2%；美羅培南/阿維巴坦對其MIC50、MIC90分別為0.125/4、0.5/4 μg/mL，阿維巴坦可將美羅培南MIC50、MIC90分別下降99.8%、99.6%。5株表達金屬β-內酰胺酶(MBLs)基因的CRKP菌株，阿維巴坦未使頭孢他啶、美羅培南MIC90值有所下降，但阿維巴坦可使氨曲南MIC90下降達99.8%。頭孢他啶/阿維巴坦、氨曲南/阿維巴坦、美羅培南/阿維巴坦對63株CRKP株菌的MBC50、MBC90值與其相應的MIC50、MIC90值相同。見表4。

表4 抗生素及其阿維巴坦復合制劑對攜帶不同基因CRKP菌株的MIC和MBC檢測結果(μg/mL)

3 討論

本組研究發現，57株攜帶blaKPC-2基因的CRKP株菌，阿維巴坦可將頭孢他啶、氨曲南和美羅培南對其MIC50及MIC90下降96.9%～99.8%；5株表達金屬酶的CRKP菌株，阿維巴坦未使頭孢他啶、美羅培南對其MIC90值有所下降，但阿維巴坦可使氨曲南對其MIC90值下降99.8%。

綜上所述，阿維巴坦聯合常見β-內酰胺類抗生素(頭孢他啶、氨曲南或美羅培南)可有效抑制攜帶blaKPC-2基因的CRKP菌株，卻不能有效抑制MBLs基因陽性的CRKP菌株；與氨曲南聯合可有效抑制blaKPC基因陽性及MBLs基因陽性的CRKP菌株。本研究受試菌株數特別是表達金屬酶的菌株有限，可以擴大受試菌株數及增加其他耐藥機制的菌株以獲取更多數據，為臨床抗CRKP感染治療提供更好的選擇。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。