動物疫病熒光PCR檢測中假陽性的原因分析與控制

張梅，高軍軍，康文彪

（甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730046）

實時熒光定量PCR技術(shù)特異性強，可以從低微含量樣本中擴增病原特異性核酸片段，實現(xiàn)對病原的精準檢測[1-2]，已被廣泛應(yīng)用于動物病原學(xué)檢測，是目前獸醫(yī)實驗室病原學(xué)檢測工作中必不可少的檢測手段。假陽性是指原本的陰性樣品被檢測為陽性結(jié)果[3]。隨著動物病原學(xué)檢測量的不斷增多，加之熒光PCR敏感度高，試驗人員為快速完成檢測任務(wù)易忽視檢測中關(guān)鍵步驟的細節(jié)問題，以致出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對疫情準確診斷造成了困擾。本文通過分析動物疫病熒光PCR檢測中可能形成假陽性的原因，并提出控制措施，以期為獸醫(yī)實驗室PCR檢測工作提供參考。

1 動物疫病熒光PCR檢測中假陽性的原因分析

造成假陽性的原因主要是樣品、試劑、環(huán)境、儀器等被污染。

1.1 樣品間交叉污染

放置樣本時由于離心管質(zhì)量問題或密封不嚴，容器外粘有樣品導(dǎo)致樣品間相互污染；核酸污染物通過氣流或?qū)嶒炄藛T流動污染實驗室局部環(huán)境、離心機、槍頭等導(dǎo)致檢測樣品間相互污染；加核酸模板時未及時更換槍頭導(dǎo)致相鄰樣品相互污染等。

1.2 PCR擴增產(chǎn)物污染

PCR擴增產(chǎn)物污染是動物疫病熒光PCR試驗中常見的污染問題，因熒光PCR擴增產(chǎn)物拷貝基數(shù)大，呈指數(shù)倍增長[3]，極微量的污染就會造成分析結(jié)果中單一通道的翹尾現(xiàn)象，PCR擴增產(chǎn)物處理不當(dāng)會出現(xiàn)大量的假陽性結(jié)果。

1.3 實時熒光定量PCR試劑污染

在熒光PCR反應(yīng)體系配制過程中，由于實驗室局部環(huán)境、移液器、耗材、反應(yīng)體系已被氣溶膠或陽性對照污染，或在DNA或RNA提取過程中使用已經(jīng)被污染的提取試劑，會出現(xiàn)樣品孔大面積陽性的結(jié)果，這也是導(dǎo)致假陽性的原因之一[4]。此外，有的廠家生產(chǎn)的不同批次的熒光PCR反應(yīng)體系試劑檢測結(jié)果的可重復(fù)性低，也會造成假陽性結(jié)果。

1.4 氣溶膠污染

PCR實驗室一半以上的污染來自氣溶膠，氣溶膠在流通的空氣中擴散，導(dǎo)致室內(nèi)環(huán)境、儀器被污染，造成假陽性結(jié)果。加樣過程中移液器加樣力度太大，或加完樣往廢液缸中打廢棄槍頭的速度太快產(chǎn)生反沖，導(dǎo)致氣泡和樣品液進入移液器頭部套筒，對活塞密封圈造成損傷，同時帶入的氣霧造成氣溶膠污染[5]；樣品開蓋前未離心或顛倒混勻時用力過猛形成氣溶膠，導(dǎo)致操作環(huán)境被污染。

1.5 陽性質(zhì)控品污染

目前獸醫(yī)分子生物學(xué)實驗室使用成熟的商品化熒光PCR試劑盒，商品化試劑盒陽性質(zhì)控品多為克隆質(zhì)粒，如非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒、口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒、禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒，質(zhì)粒生長繁殖快、生命力頑強，極易造成污染[5]，在操作不規(guī)范的情況下質(zhì)粒外溢致使假陽性概率增大。

1.6 試驗操作者的污染

檢測過程中檢測任務(wù)量大，由于過于追求檢測效率而沒有注意操作細節(jié)，不規(guī)范操作容易造成氣溶膠或擴增產(chǎn)物污染。同時，試驗操作者的實驗服、工作鞋及未經(jīng)消毒的物料外包裝等攜帶的核酸片段也會造成PCR污染[6]。

2 動物疫病熒光PCR檢測中假陽性控制措施

2.1 規(guī)范采集和運輸樣品

嚴格遵守樣品采集操作規(guī)范，確保采集樣品的容器（離心管、采血管、OP液管等）密封嚴密、運輸過程中不發(fā)生交叉污染。所采集的樣品容器管口用封口膜密封處理，送入二級生物安全柜內(nèi)無菌取樣處理，每份樣品分裝成兩份，一份檢測，一份留樣（目的是確保樣品可溯源、試驗結(jié)果有誤差時用于復(fù)核）。留樣樣品檢測完密封包裝，表面用有效消毒劑噴灑消毒后，保存于-20 ℃專用冰柜。運輸樣品需要三層包裝和專業(yè)包裝箱，以防止發(fā)生生物安全事故，最外層包裝設(shè)置向上箭頭標志；路途較遠時需全程冷鏈運輸或航空運輸。

2.2 加強儀器設(shè)備操作管理

使用儀器時嚴格按照操作規(guī)范進行，定期對精密儀器等進行校準和維護。如定期維護移液器精確度、離心機轉(zhuǎn)速、實時熒光定量PCR儀的溫控模板和性能穩(wěn)定性；定期更換生物安全柜的過濾器和空調(diào)過濾網(wǎng)。嚴禁儀器在各功能區(qū)混用，尤其是配液區(qū)的移液器不能與其他區(qū)混用。推薦使用全自動核酸提取儀[7]，實現(xiàn)自動化和封閉式操作，避免人員反復(fù)開蓋加入或倒出試劑的過程中導(dǎo)致氣溶膠污染，減少核酸抽提過程中的假陽性發(fā)生率。試驗完成后做好熒光PCR儀、金屬浴、生物安全柜、混勻振蕩器等儀器使用情況及運行狀況的記錄。儀器校準維修后做好校準、維護保養(yǎng)及驗收記錄，確保相關(guān)記錄可追溯。

2.3 健全試劑、耗材管理制度

采購國家批準廠家生產(chǎn)的特異性高、穩(wěn)定性好的熒光PCR試劑盒[8]，禁止使用過期或質(zhì)量不合格的試劑。每一批次的試劑均須加陽性質(zhì)控品或進行盲樣驗證，合格后可正常進行PCR試驗。所有熒光PCR反應(yīng)體系的分裝應(yīng)在配液區(qū)進行，試劑盒中的陽性對照及陽性質(zhì)控品應(yīng)保存在樣品制備區(qū)的冰箱[9]。及時清理配液區(qū)、樣品制備區(qū)和擴增分析區(qū)所有長時間暴露的試劑、耗材，做好試劑、耗材出入庫和使用記錄，及時對采購的試劑、耗材進行質(zhì)量驗證，不斷完善試劑、耗材管理制度。

2.4 加強對試驗人員的技術(shù)培訓(xùn)和管理

新員工開展檢測前對其進行PCR試驗檢測操作規(guī)程、試驗原理、質(zhì)量體系、生物安全管理等方面的培訓(xùn)，并通過理論考試、內(nèi)部人員比對試驗、盲樣比對等方式進行考核。所有試驗人員需經(jīng)檢測能力驗證、儀器規(guī)范操作等培訓(xùn)后持崗上證，并每年對試驗人員進行盲樣考核[10]。實驗室質(zhì)量負責(zé)人要加強對檢測人員的監(jiān)督，實行責(zé)任制。檢測人員要嚴格按照檢驗操作規(guī)程進行試驗，從配液區(qū)到擴增產(chǎn)物分析區(qū)須單向流動，注意容易發(fā)生污染的每一個細節(jié)。每次的PCR檢測需設(shè)立陰性對照、空白對照和陽性對照；已加入核酸模板的PCR反應(yīng)管禁止再次打開管蓋，避免樣本間的交叉污染；擴增產(chǎn)物分析區(qū)的物品及工作服禁止帶出，避免擴增產(chǎn)物污染；樣品使用前需先離心，再輕柔開蓋，防止液體濺出造成污染；提取核酸的關(guān)鍵步驟要及時更換一次性手套；樣品核酸模板的加樣順序依次為陰性對照、檢測樣品、陽性對照；設(shè)計好試驗對照，便于分析假陽性結(jié)果[11]。

2.5 加強實驗室環(huán)境管理

2.5.1 合理設(shè)計各工作區(qū)域 PCR實驗室至少有3個工作區(qū)，各工作區(qū)按照單方向進行PCR檢測，即配液區(qū)→樣品制備區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆行[6]。各工作區(qū)域內(nèi)的儀器、物品不得交叉使用[12]，各區(qū)域的儀器設(shè)備（移液器、生物安全柜、高速離心機等）和物品（96孔板、工作服、抹布、生物安全垃圾桶等）用防水標簽標記清楚，以便于鑒別。廢棄物臨時貯存室應(yīng)遠離PCR實驗室。

2.5.2 規(guī)范開展日常消毒 每次試驗前打開空調(diào)系統(tǒng)，對工作臺面、地面進行清潔，并用2.3%有效氯消毒劑擦拭消毒；對生物安全柜的內(nèi)表面和移液器的頭部用75%酒精和2.3%有效氯消毒劑擦拭消毒。但含氯消毒劑具有腐蝕性，消毒完成后需用純水再次擦拭。試驗結(jié)束后對廢液缸里的廢棄物進行高壓滅菌處理，并將廢液缸用84消毒液浸泡消毒；移出生物安全柜內(nèi)的所有耗材和剩余試劑樣品，將生物安全柜臺面、移液器頭部、離心機等先用75%酒精擦拭2遍，再用核酸清除劑擦拭消毒2遍，工作臺面和地面用2.3%有效氯消毒劑（現(xiàn)配現(xiàn)用）擦拭至少5 min（各工作區(qū)消毒器具不可混用）；PCR擴增產(chǎn)物用5%有效氯消毒劑浸泡12 h以上；96孔板、試管架等可重復(fù)使用的物品用5%有效氯消毒劑浸泡消毒12 h；消毒完成后打開安全柜，用移動紫外燈照射1 h。此外，要定期對PCR實驗室進行徹底清掃消毒，并對生物安全柜用3%過氧化氫熏蒸消毒4 h以上。

2.5.3 加強通風(fēng) 氣溶膠是PCR實驗室產(chǎn)生污染的原因之一，每隔一定時間須更換空調(diào)過濾網(wǎng)，并定期打開空調(diào)系統(tǒng)進行通風(fēng)換氣，降低氣溶膠造成污染的風(fēng)險。

3 結(jié)語

動物疫病熒光PCR檢測中出現(xiàn)大量陽性結(jié)果時，應(yīng)懷疑是否為PCR實驗室污染，并通過人員比對、試劑比對、盲樣比對查找原因，若為PCR實驗室污染時須采取科學(xué)的控制措施，并重新采樣，更換實驗室進行檢測，確保檢測結(jié)果的準確性。假陽性會造成疫情誤判，診斷某種動物疾病時，須結(jié)合臨床癥狀和國家制定的確診標準[13]。此外，要加強對PCR實驗室的日常管理，規(guī)范檢驗人員的操作，做好PCR實驗室內(nèi)部質(zhì)控，及時規(guī)范處置危險廢棄物（廢棄試劑、耗材、樣品、PCR擴增產(chǎn)物、防護用品等），確保熒光PCR檢測結(jié)果準確可靠。