外泌體多角度調節骨平衡治療骨質疏松癥的研究進展

李 寧，王小強△，謝興文，徐世紅，姜朝陽，李 輝，張旭明

（1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730030；4.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050）

“骨質疏松癥”一詞的意思是“多孔骨”，實際上是一種世界性的高發性代謝性骨病。其特點是骨量減少，骨脆性增加，微結構骨組織惡化。它的發生是由于骨形成和骨吸收之間的不平衡。雖然在所有種族、性別和年齡群體中都有發現，但多見于女性和老年人。直至提出這是一種由于輕微中風導致的骨折的疾病之后，才有了骨質疏松這一解釋。它被認為是與骨折和其他嚴重的次要健康問題有關的最常見的人類疾病之一。根據國家骨質疏松癥基金會（NOF）最近的報告，全世界50歲以上的人群中，每2名女性和1/4的男性在他們的余生中會因骨質疏松癥而發生骨折。目前治療骨質疏松癥癥狀主要是藥物治療，如六味地黃丸、補骨脂素等。雖然這些藥物治療取得了一定的效果，但沒有一種治療方法是完全令人滿意的，迫切需要一種新的高效、快速的治療技術。為了彌補這一不足，目前的研究引入了基因靶向治療，主要集中于靶向骨骼干細胞和成骨細胞的功能，已證實其能有效促進骨形成[1]。間充質干細胞（MSCs）的成骨分化和外泌體對于骨質疏松癥的治療具有重要意義。

1 間充質干細胞及其外泌體的現代研究

間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）是一種多功能的基質細胞，具有在體內外分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞的能力；是一種具有多種功能的干細胞，具有多分化潛能和免疫調節作用，可有效延長移植物的生存時間，調節炎癥反應，從而促進組織修復[2-3]。間充質干細胞向成熟成骨細胞的募集、增殖和分化受到多種因素的調控，包括細胞因子、全身激素、生長因子和其他調節因子。自噬可促進間充質干細胞的產生，是一種必要的細胞代謝途徑，在饑餓或氧化應激刺激下，通過清除受損的大分子和細胞器來維持細胞質內穩態，維持細胞的生存和生長[4-5]。自噬在惡劣條件下通過清除活性氧（ROS），幫助細胞成分循環，促進間充質干細胞成骨，維持骨重塑[6-7]。SATB2是一種特異的成骨細胞分化的免疫組化生物標志物，已被證明對骨和軟組織腫瘤[8]都有用。有證據表明SATB2與間充質干細胞功能、成骨活性和骨質疏松癥密切相關[9-11]。這就意味著可通過SATB2調節間充質干細胞功能、成骨活性，從而治療骨質疏松。最近，人們發現MSCs通過分泌生長因子等小顆粒介導的旁分泌作用發揮其治療作用。MSCs釋放的胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）參與了組織再生，并參與了MSCs的旁分泌作用。

外泌體是大多數細胞類型（如MSCs、樹突狀細胞、巨噬細胞、上皮細胞、B細胞、T細胞等）分泌的EVs中最小的亞群。它們也可以在大多數體液中被識別，包括血液、尿液、羊水、血清等。和細胞一樣，外泌體由脂質雙分子層組成，可以包含許多細胞的分子成分，如蛋白質、miRNAs、DNA等。目前，分離外泌體最常用的方法包括超離心法和免疫珠分離。通過電子顯微鏡發現外泌體是囊泡，呈球形或特殊的杯狀形態[12-13]。EV是包膜的囊泡，有幾種不同的囊泡形式。哺乳動物細胞可以釋放不同類型的EV。主要類型包括凋亡小體、微泡和外泌體。外泌體是EV的主要亞類之一，具有內泌體起源。外泌體是小的（301 00 nm）細胞外納米大小的囊泡，起源于多種細胞類型中多囊體的內部囊泡，如腫瘤細胞、t細胞、肥大細胞和樹突狀細胞等。最近的研究發現，外泌體在一些疾病如炎癥性疾病、心血管疾病、代謝性和神經退行性疾病等方面具有多種多樣的治療應用。外泌體作為特化的膜囊，保護miRNA不被降解，并將其在細胞間轉移以調節細胞間的信息傳遞。

2 骨質疏松癥病因及其與MSCs衍生外泌體的聯系

骨質疏松癥的發病機制是骨形成的功能損害，這是一個比較傳統的說法。然而，骨質疏松癥的病因復雜，并不單一：破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成之間的不平衡;成骨分化減少；脂肪分化增加等因素皆可引起該病。骨質疏松癥與血管生成也密切相關。從動物、細胞和患者的研究中積累的證據表明，局部血供或血管生成的減少有助于骨質疏松癥的發生。此外，miRNAs介導機制的解除也成為骨質疏松癥[14]等骨相關疾病的重要病理因素。骨質疏松癥的發病機制與成骨細胞和破骨細胞活性失衡有關。由于成骨細胞和脂肪細胞具有共同的前體，在衰老過程中，MSCs的細胞系向骨髓中的脂肪細胞轉移，導致骨質疏松癥。

MSCs的數量多少決定著所分化的子細胞的數目，而MSCs分化是一個復雜的過程;許多因素影響間充質干細胞向成骨細胞或脂肪細胞的分化，以及骨質疏松條件下的骨形成。所謂骨質疏松癥與血管生成密切相關，筆者認為其本質是MSCs衍生的外泌體對血管生成起著決定性作用。此外，MSCs衍生外泌體還可通過調節脂肪細胞間接治療骨質疏松。

3 多角度調節骨穩態

3.1 外泌體的成骨與破骨作用

Ma等[15]的研究表明，從生物結構上講，間充質干細胞的成骨分化是骨質疏松癥治療的關鍵。MSCs對于骨質疏松癥患者可起到直接或間接的作用。Yang[16]等研究發現LncRNA MALAT1由骨髓源間充質干細胞分泌的外泌體穿梭，通過介導microRNA-34c/SATB2軸減輕骨質疏松癥；Corrado等研究的一項關鍵發現表明，BMSCs-derived的外泌體轉移相關肺腺癌轉錄本1（MALAT1）可能促進成骨細胞活性。外泌體能夠主動地在miRNAs、蛋白質和mRNA之間運輸和傳遞信息到靶細胞，從而影響其行為，強烈地改變整個微環境。Sun等[17]的研究表明來自破骨細胞的含miRNA的外泌體選擇性地抑制成骨細胞活性，使得成骨細胞數目大于破骨細胞。研究表明[18-19]，成骨細胞來源的外泌體調節破骨細胞活性，外泌體在骨微環境和骨代謝中發揮作用。

有研究結果表明，來自骨髓間質干細胞的外泌體miR-31a-5p通過靶向RhoA的30UTR并抑制其活性來促進破骨細胞的分化，由外泌體包裝的BMSC來源的miR-31a-5p不僅影響成骨分化，而且通過外泌體在細胞之間的穿梭影響破骨分化。這一雙重調控表明，miR-31a-5p在衰老過程中的骨形成和骨吸收中起著重要的調節作用。MSCs來源的外泌體在骨質疏松癥治療中的作用骨形成是骨質疏松癥發病的關鍵過程，促進骨形成對骨質疏松癥的治療具有重要意義。MSCs來源的外泌體可增強體外rBMSCs-OVX成骨細胞ALP活性，上調成骨細胞基因mRNA和蛋白表達。同時，MSCs衍生的外泌體也可以刺激去卵巢大鼠中臨界大小顱骨缺損的骨再生。此外，間充質干細胞衍生的外泌體可與I型膠原、纖維連接蛋白等基質蛋白結合，并誘導體外和體內的成骨細胞分化。有趣的是，除了MSCs來源的外泌體外，當與-TCP支架結合時，TCP的成骨活性可以通過激活PI3K/Akt信號通路而增強。考慮到MSCs來源的外泌體在體內和體外的成骨能力，來自MSCs的外泌體可能是有希望改善骨骼疾病如骨質疏松癥的骨形成的囊泡。

3.2 外泌體促血管生成繼而促進骨再生

血管生成是從原有的血管中萌發出新的血管的過程。越來越多的證據表明，局部血供或血管生成減少在骨質疏松中起重要作用。因此，促進血管生成是促進骨質疏松性骨再生的基本策略。各種研究已經證明了MSCs衍生的外泌體對血管生成關鍵步驟的影響。有發現hiPSC-MSCs來源的外泌體可直接促進HUVECs成纖維細胞的血管生成和膠原合成。同樣，另一項研究得出結論，MSCs衍生的外泌體可以激活血管生成相關的分子表達（如PGF），促進HUVECs遷移和管形成。此外，血管生成在許多生理過程中起著至關重要的作用，它需要內皮細胞與周圍環境的緊密相互作用。MSCs來源的外泌體可能通過靶向治療。MSCs來源的外泌體可以通過促進內皮細胞尖端細胞的形成來調節內皮細胞的血管生成。總之，MSCs來源的外泌體作為促血管生成因子可能是治療骨質疏松癥的一個有希望的候選因子。

3.3 MSCs源性脂肪細胞調節骨關系

在骨髓中，成骨細胞和脂肪細胞有一個共同的前體細胞MSCs。積累的信息表明，骨質疏松癥使骨髓間充質干細胞的命運偏向于脂肪細胞而不是成骨細胞，并隨著骨髓脂肪的堆積而減少骨量。Martin等人發現，人間充質干細胞（HMSCs）來源的脂肪細胞可以分泌包含成脂特異性mRNA（如瘦素、ppparg、CEBPa和CEBPd轉錄本）和抗成骨miRNAs（miR30c,miR-31,miR125a,miR-125b,miR-138）的外泌體，并可轉移到MSCs來源的成骨細胞。MiR-30c和miR-31靶向成骨轉錄本RUNX2和Osterix，調節成骨分化。miR-125a和miR125b在人脂肪源性干細胞成骨分化過程中顯著下調。miR-138調節hMSCs的成骨分化，過表達miR-138減少骨形成[20]。由于miR-30c、miR-31、miR-125a、miR-125b和miR-138具有抑制成骨細胞基因表達的能力，本研究中miR-30c、miR-31、miR-125a、miR-125b和miR-138的表達均有所增加。這些結果可能暗示外泌體中的miRNA可能抑制成骨分化。這些發現表明，MSCs來源的外泌體可能是骨質疏松癥治療中調控成骨細胞和脂肪細胞之間關系的靶成分。

3.4 外泌體調節免疫達到骨穩態

骨修復的過程需要炎癥反應，因為免疫系統會對多種細胞因子做出反應，這些細胞因子招募并激活多種類型的細胞，如MSCs，以促進骨形成。據報道，MSCs分泌的外泌體有助于免疫系統的調節。炎癥失調導致骨吸收增加和骨形成抑制。T細胞已被確定為不同疾病（如骨質疏松癥）中破骨細胞和成骨細胞形成及活性的關鍵調節因子。MSCs來源的外泌體對T細胞的分化、增殖和激活具有抑制作用：MSCs來源的外泌體可能調節免疫系統并影響骨代謝，提示MSCs來源的外泌體在無細胞治療骨質疏松癥中的潛在臨床應用。

4 總結與展望

人類骨骼是一個代謝活躍的組織，在整個生命過程中經歷不斷的更新和重塑。在穩態條件下，成骨細胞介導的骨再生和破骨細胞介導的骨吸收之間存在微妙的平衡。這一過程的異常可產生多種骨骼疾病。使用MSCs衍生的外泌體有幾個優勢。第一，避免了可能導致DNA突變或損壞的細胞的轉移;第二，囊泡較小且易于循環；第三，外泌體不含MHCI蛋白，可以克服細胞移植治療的一些缺點；第四，MSCs來源的外泌體不像細胞那么復雜，因此它們更容易產生，也有可能避免一些在MSCs中面臨的調控問題。綜上所述，MSCs衍生的外泌體可能在不久的將來成為治療骨質疏松癥等骨骼疾病的理想工具。