云南地方稻耐低鉀種質資源的篩選和評價

唐海浪，程在全，羅 瓊*，鐘巧芳*

（1.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南省農業科學院 生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點試驗室/農業農村部 西南作物基因資源與種質創制重點試驗室，云南 昆明 650205）

鉀是植物生長發育必需的三大營養元素之一，與植物的各種代謝密切相關，在作物的生長、產量、品質和抗逆性等方面具有重要作用［1－3］。水稻（Oryza sativa L.）是我國重要的糧食作物之一，60%的人口以稻米為主食。水稻生長所需的鉀營養主要來自土壤，而我國1/4~1/3的耕地土壤處于缺鉀或嚴重缺鉀狀態，在南方稻區土壤缺鉀尤為嚴重。我國鉀資源匱乏，鉀肥年產量少，所需的大量鉀肥主要依靠進口［4］。為了保證水稻的高產穩產，生產者長期偏重施用鉀肥。鉀肥的長期大量增施，不僅造成生產成本增加、肥料利用率降低、土壤肥力下降，而且還帶來稻米品質下降、環境污染等一系列問題［5－7］。充分利用我國豐富的水稻種質資源，發掘水稻自身的遺傳潛力，培育耐低鉀水稻品種是解決我國鉀資源短缺等問題，促進水稻生產可持續發展的有效途徑［8－10］。優異耐低鉀水稻資源的發掘是水稻鉀高效育種的關鍵和基礎。大量研究表明，不同基因型水稻的鉀素吸收利用能力存在明顯差異［11-14］，且這種能力是受遺傳控制的數量性狀［15-18］。已有研究表明，耐低鉀基因型對低鉀脅迫具有較強的耐性，能夠保持較強的生長勢、較高的鉀吸收和利用效率，而且能夠獲得較高的產量。目前在鉀高效水稻種質資源篩選、耐低鉀遺傳機制、QTL定位及相關基因等方面已取得較好的進展。劉國棟等利用水培法對86種不同秈稻材料進行了篩選比較，發現其吸鉀速率、生物量和鉀素利用效率的基因型差異十分顯著，吸鉀速率的基因型差異可達1倍［19］。張寧等利用2個不同供鉀濃度的水培試驗，以相對耐低鉀指數為評價指標，篩選出2個耐低鉀水稻品種、6個中等耐低鉀水稻品種和1個鉀敏感品種［20］。王廣洋等利用水培法對257份水稻種質進行了篩選比較，發現供試水稻種質在低鉀耐性上存在顯著差異，并從中篩選出8個耐低鉀品種［21］。陳璇利用混池分組分析法對由20個耐低鉀植株和20個不耐低鉀植株分別混合成的2個樣本池及親本進行全基因組重測序，通過對候選的36個多態性位點進行功能注釋，找到了2個可能在低鉀條件下參與水稻鉀離子吸收或轉運的耐低鉀候選基因OsHAK3和OsNAC25［22］。Venkata等利用IL群體檢測到3個鉀離子濃度的QTL和4個相對莖葉鉀含量的QTL，可解釋表型變異的5.84%~14.80%［15］。羅曦等根據綜合指數從159份遺傳差異較大的水稻品種中篩選出18份耐低鉀和10份低鉀敏感的水稻品種。利用耐低鉀水稻品種臺農67和低鉀敏感品種制西構建重組自交系，共檢測到27個耐低鉀相關性狀的QTL，其LOD值為2.52~9.23，可解釋表型變異的2.22%~7.25%，其中貢獻率最高的QTL是qKC-2，該QTL定位在水稻2號染色體上，可能是1個控制水稻鉀含量的未知基因［18］。有關不同水稻基因型鉀素營養效率的差異，國內外學者已經進行了大量研究，但目前對水稻鉀高效基因型還沒有統一的篩選指標和可靠的評價體系。傳統的研究多以大田成熟期產量作為評定品種耐低鉀的主要標準，但明顯存在周期長、費工費時、不易重復等缺點；相比之下，苗期鑒定具有耗時短、容量大、重復性強、易于活體鑒定和環境影響小等優點［10，18，20－21，23］。因此，選擇合適的苗期篩選指標，建立科學、快速、有效的苗期耐低鉀基因型鑒定方法，對大量的鉀高效基因型篩選工作具有重要的意義。云南是世界上最大的稻種遺傳生態多樣性中心之一，分布了大量豐富多樣的地方特色水稻品種資源。這些資源具有許多優良的遺傳特性及其控制基因，是寶貴的基因庫，從中發掘優異耐低鉀種質資源的可能性非常大［24-27］。鑒于此，本研究采用水培法對已進行大田抗病性鑒定的84份云南地方稻種質材料進行了耐低鉀篩選和評價，并獲得了一些優異的耐低鉀水稻資源材料，可為耐低鉀水稻種質創新和耐低鉀水稻優良品種培育提供優良的材料，同時為水稻耐低鉀基因的發掘以及水稻耐低鉀機制的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

前期經大田抗病性鑒定挑選出的具有較好抗病能力的84份云南地方稻種質材料（表1），由云南省農業科學院作物種質庫提供。

表1 供試的84份云南地方稻種質材料信息

1.2 水稻苗的水培培養

水培營養液參照國際水稻所的水培配方（稍作改良）［23］，配制成除K+濃度不同，其余成分完全相同的完全營養液和低鉀營養液，調節pH值至5.5～5.8。將不同基因型的水稻種子分別取50粒，加入3%的過氧化氫溶液滅菌消毒30 min，再用滅菌蒸餾水洗5~8次，然后轉入滅菌的組培瓶內，置于28 ℃恒溫培養箱中暗培養2~3 d，直至水稻露白。隨后在28 ℃下光照培養8~10 d，待水稻苗生長至2葉期時，從中選取長勢一致的水稻苗，去其胚乳，采用根朝下、芽朝上的方式將其移入去底的潔凈96孔PCR板中，在蒸餾水中過渡水培3~5 d，然后將其轉入完全營養液或低鉀營養液中培養，每3 d更換1次營養液，直至水稻苗生長至5葉期。每個水稻材料設置8個重復，試驗重復3次。

1.3 最適宜低鉀脅迫濃度的確定

隨機選取8個不同的水稻材料，按上述方法進行水培培養，在2葉期時分別將其移入0、0.5、1、2、3、4、5、10、20、40 mg/L共10個不同的鉀離子濃度營養液中，在28 ℃條件下，每天光照培養16 h，暗培養8 h；待培養至5葉期時，觀察植株的生長情況和缺鉀癥狀，并測量每份材料的根長、株高、鮮重，干重等指標，篩選出最適宜的低鉀脅迫濃度。

1.4 植株耐低鉀能力相關指標的測定

將待篩選的84份地方稻資源同時置于低鉀營養液和完全營養液雙濃度水培液中，將其培養至5葉期。在培養過程中，注意觀察水稻的生長發育情況和缺鉀癥狀。待生長至5葉期時，測量植株單株的根長、株高、地上部鮮重、地上部干重等性狀指標。在測量植株鮮重后，收集植株地上部，將其置于烘箱（105 ℃）中殺青10 min，然后在80 ℃下烘至恒重，最后稱重。

1.5 耐低鉀品種的綜合評價

計算不同基因型水稻幼苗各性狀的相對耐性指數（低鉀脅迫下的測定值/正常供鉀下的測定值）。采用平均分配權重法，選擇根長、株高、鮮重、地上部干重這4個苗期主要性狀的相對耐性指數，計算耐低鉀綜合指數（SYI），SYI=同品種4個性狀的相對耐性指數之和/4。再根據耐低鉀綜合指數，按照表2中的評價標準，對各水稻材料苗期的耐低鉀能力進行綜合評價，最終篩選出較優異的耐低鉀水稻品種。

表2 水稻苗期耐低鉀綜合指數的評價標準

2 結果與分析

2.1 最適宜低鉀脅迫濃度的確定

8個地方稻材料在不同K+濃度處理下的5葉期生長情況如圖1所示，在0~2 mg/L K+濃度范圍內，隨著K+濃度升高，植株生長越旺盛，株高增高，葉片變綠，缺鉀癥狀越少，根系越發達。當K+濃度為2 mg/L時，水稻生長發育狀況明顯得到改善，葉片無缺鉀癥狀，根系比較發達。當K+濃度繼續升高至3~20 mg/L范圍時，與完全營養液下的水稻相比，水稻的生長發育（如株高和根長等）反而受到了不同程度的抑制，葉尖變黃，植株變矮，出現缺鉀癥狀。

圖1 部分地方稻材料在不同K+濃度水培液中的生長情況

不同K+濃度處理對8個地方稻材料株高、根長、鮮重、干重等性狀的影響如表3所示，在不同K+濃度處理下，8個材料的株高、根長、鮮重、干重有顯著差異。當K+濃度為2 mg/L時，株高、根長、鮮重、干重這4個性狀均顯著升高，8個材料的生長狀態和性狀值最接近完全培養條件下的。因此確定以2 mg/L作為水稻苗期耐低鉀篩選的最佳低鉀脅迫濃度。

表3 不同K+濃度處理對水稻苗期株高、根長、鮮重、干重的影響

2.2 不同水稻基因型的苗期耐低鉀相關性狀差異

在2種不同鉀濃度營養液中，5葉期不同水稻材料間的生長發育情況出現了明顯差異（圖2）。在低鉀培養液中，不耐低鉀水稻出現明顯的缺鉀癥狀，植株矮小，葉片發黃，出現褐斑，根系細弱，逐漸枯死。耐低鉀水稻的生長狀態接近于完全營養液中的，直至5葉期時生長發育仍良好，根系發達，缺鉀癥狀不明顯（圖3）。

圖2 在2種K+濃度下部分地方稻材料在5葉期的生長情況

圖3 在低鉀（2 mg/L）脅迫下不同材料在5葉期的根系和株高表現

在2種鉀濃度處理下，5葉期水稻株高、根長、鮮重和干重的數據統計和方差分析結果如表4所示，發現株高、根長、鮮重和干重這4個性狀在不同K+濃度處理和不同基因型間均存在顯著差異。

表4 在兩種鉀濃度下水稻苗期耐低鉀相關性狀的差異

2.3 不同基因型水稻苗期耐低鉀性狀的相對耐性指數差異及相關性分析

為了消除不同水稻基因型之間的生物學特性差異，引入相對耐性指數（R）作為鉀高效水稻種質篩選的相對指標。在2種鉀濃度處理下，株高、根長、地上部鮮重和地上部干重這4個苗期性狀的相對耐性指數如表5所示。從表5可以看出：在4個性狀中，地上部鮮重和地上部干重的相對耐性指數都較小，平均值分別為68.27%和70.09%；株高和根長的相對耐性指數均較大，平均值分別為91.70%和115.88%。這說明地上部鮮重和地上部干重對低鉀脅迫較敏感，遺傳力小；株高和根長對低鉀脅迫不敏感，遺傳力大。從變異系數可知，株高、根長、地上部鮮重和地上部干重的相對耐性指數的變異都比較大。

表5 在2種鉀濃度處理下水稻苗期性狀的相對耐性指數

在2種鉀濃度處理下，84份地方稻苗期相對株高、相對根長、地上部相對鮮重和地上部相對干重的分布頻數如圖4所示。從圖4中可以看出，在低鉀處理下水稻的株高、根長、地上部鮮重和地上部干重均明顯低于正常處理下的。具體來說，相對株高的范圍為34.83%～175.64%，主要分布在60%～90%，均值為91.70%；相對根長的范圍為57.23%～281.63%，主要分布在65%～150%，均值為115.88%；地上部相對鮮重的范圍為25.22%～130.50%，主要分布在35%～110%，均值為68.27%；地上部相對干重的范圍為23.28%～121.00%，主要分布在50%～95%，均值為70.09%。

圖4 84份地方稻苗期耐低鉀性狀的相對耐性指數的分布頻率

各性狀相對耐性指數之間的相關性分析結果如表6所示，結果表明：株高與根長、地上部鮮重和地上部干重均呈顯著相關，相關系數分別為0.402、0.395和0.420。

表6 各性狀相對耐性指數之間的相關系數

2.4 耐低鉀品種的綜合評價

在2種鉀濃度處理下，84份地方稻苗期株高、根長、地上部鮮重和地上部干重的耐低鉀綜合指數的分布頻率如圖5所示。綜合指數的分布范圍為0.368～1.480，主要分布在0.67～1.00，均值為0.865。根據綜合指數并結合稻苗的實際生長表現，對84份地方稻材料的耐低鉀能力進行綜合評價和等級劃分（表7），最終篩選出11個耐低鉀品種（表8），這些材料苗期各性狀的相對耐性指數均高于90%，且SYI＞1.1；另外篩選出20個較耐低鉀品種（SYI為0.903～1.480）。

圖5 84份地方稻苗期4個性狀的耐低鉀綜合指數的分布頻率

表7 84份地方稻苗期耐低鉀能力的綜合評價結果

表8 耐低鉀品種的相對耐性指數和耐低鉀綜合指數

3 小結與討論

鉀是植物生長必需的元素之一，與植物的生長發育和新陳代謝等密切相關。前人諸多研究表明，不同基因型水稻在低鉀耐性上具有明顯的遺傳差異性［11-14］，這為從云南豐富多樣的地方稻資源中篩選和培育優異耐低鉀水稻種質提供了理論依據和可能性。本研究發現，在低鉀（2 mg/L K+）條件下，84個云南地方稻品種的性狀表現出明顯差異，其中株高、地上部鮮重和地上部干重這3個性狀的平均值均小于正常處理，而根長的平均值明顯高于正常處理；在低鉀條件下，大部分稻苗（63.10%）均表現出不同程度的植株矮小，生長緩慢，莖稈細弱，葉呈現褐斑，下部葉片發黃，部分品種（36.90%）生長狀況較佳，接近于正常處理，但也有少部分品種（13.10%）的性狀甚至超過正常處理的，這與已有的研究結果［10-13，18-21，23］基本一致。

目前有關水稻鉀高效基因型篩選的研究很多，在這類研究中水培法、盆栽法、大田試驗法等都是常用方法。但總體而言，水稻鉀高效基因型的篩選目前還缺乏統一的篩選指標和可靠的評價體系。由于盆栽法和大田試驗法等難以控制單一因素的缺乏且生長周期長，易受天氣、季節和氣候的影響等，對于大規模的批量篩選可行性低［10，18，20－21，23］。本試驗采用水培法，與大田試驗相比，水稻的生長條件如溫度、水分、光照可人工調控，減少了不可控因素對耐低鉀水稻篩選的影響，且鑒定周期短、更高效。此外本試驗鑒定材料的數量多，將材料置于去底的96孔PCR板上進行培養，不僅節省了空間和成本，而且操作相對簡便有效，可以作為大規模品種前期高效、快速篩選的方法之一。

本試驗在2 mg/L低鉀處理下，利用由株高、根長、地上部鮮重和地上部干重這4個性狀的相對耐性指數構成的綜合指數作為耐低鉀能力的評價指標，最終篩選出11個耐低鉀地方稻品種（小紅早谷、遲考皮、高糯、勐選二號、白齊頭谷、花谷、白香糯、紅根細、冬大白、紫稈谷和冷水谷）。但這一苗期鑒定結果具有一定的局限性。為了更全面地評價這些材料的鉀高效特性和產量潛力，后續還需進行大田試驗鑒定，研究這些品種在不同生育期吸收利用鉀的情況，并結合株高、穗長、單株產量、結實率、千粒重等主要產量性狀進行綜合篩選和評價，以獲得更有應用潛力的鉀高效水稻材料。