bHLH轉錄因子在植物低溫脅迫中的研究進展

陳柳君

（重慶大學 生物工程學院，重慶 400044）

bHLH（basic helixloop-helix）家族轉錄因子是廣泛存在于真核生物中一類重要的轉錄因子家族，也是最大的幾個家族之一。bHLH蛋白首先被發現于小鼠肌肉發育的研究中［1］，隨后，在動植物、真菌在內的所有真核生物中被鑒定［2］。擬南芥作為開花植物的模式植物，已從基因組序列分析中鑒定出162個bHLH編碼基因，在水稻中則鑒定出167個［3-5］，在玉米中鑒定出208個可能的bHLH家族蛋白［6］。研究人員發現bHLH家族成員在動植物的基本生理發育、次生代謝產物的合成調控、抗逆境等過程中具有越來越多的功能。

1 bHLH轉錄因子的結構特征及分類

bHLH家族蛋白保守結構域約含60個氨基酸，含有堿性區域 （basic region） 和α螺旋1-環-α螺旋2 （helix-loop-helix，HLH）兩個亞功能區［7］。HLH區含有兩個兩親性α螺旋，由一個長度可變的連接環連接，兩個bHLH蛋白的兩親性α螺旋之間可以發生相互作用，形成同源二聚體或異源二聚體；堿性區域位于bHLH蛋白保守結構域的N端，含有約15個氨基酸，其中約6個堿性殘基，其主要功能是識別和特異性結合靶基因啟動子中的DNA基序，即能識別并結合E-box（5’-CANNTG-3’）、G-box（5’-CACGTG-3’）等順式作用元件［8-9］，這也是使bHLH蛋白具有轉錄因子功能的原因。在構成bHLH蛋白保守結構域的60個氨基酸中，有19個氨基酸是高度保守的，其中有5個位于第一螺旋區（helix），5個位于堿性區域（Basic），1個位于環區（loop），此外還有8個氨基酸位于第二螺旋區（helix）［10-11］。然而，高度保守的bHLH結構域以外的序列并不保守，往往具有較大差異［12］。

Heim等對編碼擬南芥（Arabidopsis thaliana）bHLH家族蛋白的基因進行整體研究，已鑒定出12個亞家族［4］，而Toeldo-Oritz等人根據親緣關系將把擬南芥的bHLH基因劃分為21個家族［11］。Li等［5］根據系統發育進化關系、內含子/外顯子結構和蛋白質的結構將水稻（Oryza sativa L.）bHLH基因劃分為22個家族，并且系統地將模式植物擬南芥和水稻中的bHLH基因歸類為25個家族，又根據bHLH結構域的N端序列特征以及與DNA結合的不同特性，將水稻和擬南芥的bHLH基因分為4個亞組，如圖1所示。Pires N等［13］對9種陸地植物和藻類的全基因組序列進行分析，系統發育分析表明，植物bHLH蛋白為單系，根據進化樹的拓撲結構、分支支持值、分支長度和對bHLH氨基酸序列的目測，定義了26個bHLH蛋白亞家族，每一個亞家族的代表蛋白結構特點如圖2所示。

圖1 OsbHLH和AtbHLH蛋白bHLH結構域的DNA結合特性預測［5］

圖2 具有代表性的植物蛋白bHLH結構域的比對［13］

2 與低溫脅迫有關的bHLH轉錄因子

持續低溫脅迫對植物的生長發育有不利影響。在低溫下，植物的光合作用效率降低，根、莖、葉的代謝被抑制，細胞結構不穩定，甚至導致植物細胞的死亡［14］。轉錄因子通過激活下游的寒冷和脫水反應基因來賦予植物耐冷性，許多冷反應和脫水反應基因的啟動子中有一個或多個DRE/CRT順式元件的拷貝，其核心序列為CCGAC，一個被稱為C-repeat/dehydration-responsive element Binding Factor（CBFs/DREB1s）的轉錄因子家族蛋白可以與該元件結合并激活下游低溫反應基因（Cold-regulated genes，CORs）的轉錄［15-16］。Gilmour等［17］認為，COR基因的誘導涉及兩步級聯的轉錄激活因子，COR受到CBF/DREB轉錄因子家族蛋白的直接激活，而CBF家族蛋白又由一種被低溫誘導的轉錄因子激活，Gilmour將其命名為inducer of CBF expression（ICE）。

2003年，Chinnusamy等［18］在擬南芥中成功分離出轉錄因子ICE1，經鑒定，ICE1轉錄因子具有bHLH結構域，與CBF3基因啟動子中的MYC識別位點具有特異性相互作用，過表達ICE1能夠增加CBF家族轉錄因子的表達水平，從而提高轉基因植物的抗凍性。2009年，Fursova等［19］在擬南芥中鑒定出與ICE1具有類似功能的ICE2，能夠激活CBF1基因的表達，過表達ICE2導致轉基因擬南芥在冷馴化后對深度冷凍脅迫的耐受性增加。除了擬南芥之外，對CBF蛋白具有誘導表達作用的bHLH轉錄因子在許多植物中被陸續鑒定出來。Badawi等［20］從冷處理的小麥（Triticum aestivum L.）體內分離了擬南芥AtICE蛋白的兩個同源物TaICE41和TaICE87，兩種TaICE蛋白都能激活TaCBFIVd-B9的轉錄，在冷馴化時能增強小麥的抗冷性。2012年，Feng等［21］從蘋果（Malus domestica）中克隆了MdCIbHLH1，發現MdCIbHLH1蛋白能與MdCBF2啟動子結合并上調其表達水平，使得轉基因蘋果植株的抗寒性增加。2018年，與MdCIbHLH1功能相似的MdbHLH33被 發 現，MdbHLH33通 過 與MdbHLH308相 互 作用來增強對MdCBF2和MdDFR啟動子的激活，調節MdCOR15A的表達，除了賦予植株耐寒性外還能增加寒冷條件下花青素的積累［22-23］。在番茄（Solanum lycopersicum）中也發現了擬南芥AtICE1的同源物SlICE1a和SlICE1，過度表達SlICE1和SlICE1a的轉基因植物表現出更高的SlCBF基因和SlDRCi7等冷反應基因的表達水平，過表達SlICE1a的煙草（Nicotiana tabacum L.）表現出更高的脯氨酸、可溶性糖和晚期胚胎發生豐富蛋白（late embryogenesis abundant，LEA）的水平，植物的抗冷性得以增強［24-25］。在擬南芥中超表達從杭菊（Chrysanthemum morifolium）中分離的CmICE2后，CBF、COR基因的表達水平以及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性提高，賦予了轉基因擬南芥抗凍性［26］。在梨（Pyrus ussuriensis）中，分離到與AtICE1高度同源的PuICE1基因，PuICE1蛋白與PuHHP1相互作用，調節PuDREBa轉錄水平，參與ABA獨立信號通路，以響應低溫［27］。在異色菊（Chrysanthemum dichrum）中，CdICE1基因不僅能在4 ℃時促進CBF基因的表達，在16 ℃時還能觸發MicroRNA 介導的另一條抗冷途徑：16 ℃下，超表達CdICE1的擬南芥在miR398下調，使超氧化物歧化酶1（Copper/zinc Superoxide Dismutase 1，CSD1）和超氧化物歧化酶2（Copper/zinc Superoxide Dismutase 2，CSD2）的積累增加，從而增加轉基因擬南芥的活性氧清除能力和抗冷能力［28］。

除了通過CBF途徑之外，許多bHLH蛋白也通過增加活性氧清除能力、多胺積累等方式參與植物抵抗低溫脅迫。Geng等［29］在橙子（Citrus sinensis）中發現了一個bHLH家族蛋白CsbHLH18，其能直接特異性結合并激活CsPOD啟動子，通過調節抗氧化基因來調節ROS內穩態，從而在抗寒性中發揮積極作用。Gao等［30］在香蕉（Musa acuminaa L.）中克隆了MaICE1基因，并發現MaICE1能促進過氧化物酶基因MaPOD P7（peroxidase P7）的表達，正向調控了香蕉的抗寒性。在枸桔（Poncirus trifoliata）中，bHLH家族蛋白PtrICE1被發現能夠與枸桔精氨酸脫羧酶（ARGININE DECARBOXYLASE，PtADC）相互作用，促進多胺水平的積累，在超表達PtrICE1的轉基因植株中，多胺水平增加，活性氧水平降低，并且表現出比野生型更強的寒冷耐受能力［31］。水稻OsbHLH002蛋白可直接靶向編碼關鍵海藻糖生物合成酶（trehalose-6-phosphate phosphatase）的OsTPP1基因，導致低溫脅迫下海藻糖的積累，在不改變生長的情況下提高水稻對非生物脅迫的耐受性［32］。

最近的研究還發現，bHLH家族的光敏色素互作 因 子（phytochrome interacting factors， PIFs）除了參與光敏色的素信號途徑之外，還能夠對光信號和低溫信號進行整合，從而使植物更好地適應低溫脅迫。擬南芥AtPIF4和AtPIF7在長日照的條件下下調CBF途徑并抑制其抗凍性，而在短日照條件下這種抑制被解除［33］。Jiang等［34-35］發現擬南芥的AtPIF3是一個低溫響應的負調控因子，直接與CBF基因的啟動子結合，并抑制其表達。而水稻中的OsPIL16與AtPIF3具有相反作用，其可以與OsDREB1B啟動子的N-Box區域結合，在冷脅迫時上調OsDREB1B的表達［36］。橙子中的CsPIF8直接結合CsSOD啟動子E-box區域（CANNTG），激活CsSOD的表達，通過提高SOD的活性和水平來抵抗低溫，異源表達CsPIF8提高了轉基因番茄植株和葡萄柚愈傷組織的耐寒性，而病毒介導的CsPIF8則抑制了柑橘幼苗的耐寒性［37］。而在番茄中，SlPIF4不僅直接與SlCBF基因的啟動子結合并激活其表達，還調節植物激素的生物合成和信號，包括脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和赤霉素（GA）對低溫的響應，SlPIF4在低溫脅迫下直接激活對低溫耐受性有正向調節作用的SlDELLA基因（GA-INSENSITIVE 4，SlGAI4）［38］。

越來越多的bHLH家族轉錄因子在植物低溫脅迫方面的功能被鑒定，表1對這些轉錄因子作了一個匯總，并簡要描述了它們的功能［39-56］。

表1 與低溫脅迫相關的bHLH家族基因

3 bHLH家族轉錄因子參與低溫脅迫的相關機制

3.1 ICE-CBF途徑

CBF是AP2/EREBP類結合蛋白（Apetala2/Ethylene-responsive element binding protein）的一種，通過AP2/ERF結構域，CBFs與冷調節基因COR啟動子中的CRT/DRE（C repeat/Dehydration response element 1）元件結合并誘導其表達［57］。CBFs還能提高脯氨酸和總糖的水平以保護蛋白質和膜免受冷凍損傷［58］。在正常溫度下CBFs的表達幾乎檢測不到，在低溫時CBF基因會受到誘導表達［57］。bHLH家族轉錄因子ICEs（inducer of CBF expression）被認為是CBFs的誘導因子，已有許多研究證明當植物處于低溫條件時，通過ICEs激活CBF基因的啟動子，從而使下游的冷反應基因比如COR15A、COR47、cold-inducible gene（KIN1）、responsive to desiccation 29a（RD29A）等表達水平上調，植物得以具有更高的低溫耐受力［18，19，22，26，54］。研究顯

示，ICE-CBF低溫脅迫的相應途徑受到多種轉錄因子和蛋白的調控。在寒冷條件下ICE誘導的CBF大量表達具有時效性，一般持續幾日表達量便會下降到溫暖條件時的水平，這種機制是由于一種E3連接酶HOS1（HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENE 1）對ICE的泛素化降解介導的，在hos1突變體中ICE1未被降解，CBFs的表達更加持久，而過表達HOS 1抑制CBFs及其下游基因的表達［59］。植物低溫反應的早期，SIZ1（SAP AND MIZ1 DOMAIN- CONTAINING LIGASE 1）介導ICE1的 SUMO修飾，由低溫直接或間接誘導SIZ1的翻譯后修飾，進而對ICE進行SUMO修飾（sumoylation） 并誘導調控耐寒基因表達的信號級聯。另外，SIZ1介導的SUMO修飾和HOS1介導泛素化可以在同一底物上競爭性地與底物相互作用，以調節ICE及CBFs途徑［60］。OST1（OPEN STOMATA 1）是ABA信號中一種眾所周知的Ser/Thr蛋白激酶，可被冷應激激活，激活的OST1磷酸化ICE1并增強其穩定性和轉錄活性，同時，OST1還能夠干擾HOS1和ICE1之間的相互作用，從而抑制冷脅迫下HOS1介導的ICE1降解［61］。CBF啟動子還具有MYB識別序列，MYB15（MYB DOMAIN PROTEIN 15）與CBF基因啟動子中的MYB識別序列結合抑制其表達，另外，ICE1可直接（SUMO化后與MYB15啟動子結合）或間接（即通過其下游基因）減弱MYB15在寒冷條件下的表達［62］。絲裂原激活蛋白激酶（MITOGENACTIVATED PROTEIN KINASE，MAP/MPK）級聯是將環境刺激轉化為細胞反應的重要信號模塊。Zhao等［63］發現，冷激活的MPK3和MPK6 能夠將ICE1磷酸化并促進其降解，從而負調節冷反應，而MPK4通過組成性抑制MPK3和MPK6活性來正調節冷反應。而Choudhury等［64］發現，MPK3/MPK6介導的ICE1磷酸化并不影響HOS1-ICE1的相互作用，它們對ICE磷酸化的位點不同，同時Li等提出一種模型：OST1在冷應激的早期階段被激活，并磷酸化ICE1以抑制HOS1介導的降解，當ICE1水平隨之累積時，ICE1被MPK3/MPK6磷酸化并通過某種機制降解。然而在水稻中，OsMAPK3對抵抗低溫脅迫有正向作用，Zhang等［32］發現經過OsMAPK3磷酸化的OsbHLH002可以促進OsTPP1的表達，增加海藻糖含量以提高抗冷害性；Xia等［44］則 發 現OsMAPL3及 其 靶 基 因OsbHLH002的磷酸化能夠被2C PROTEIN PHOSPHATASE

（OsPP2C27）去除，負調控OsMAPK3-OsbHLH002-OsTPP1信號通路，阻止冷應激正途徑的持續激活，當冷信號延長數小時后，OsPP2C27使磷酸化OsMAPK3去磷酸化以抑制冷信號。同樣，與擬南芥相反，人們發現在香蕉中MaMAPK3對提高抗寒性也有積極作用［30］。

3.2 清除活性氧以及聯合光信號、激素信號等其他機制

活性氧（ROS）導致氧化應激，低溫脅迫通常會導致有毒分子ROS的過度積累，對細胞成分（包括蛋白質、脂質和DNA）造成氧化損傷，消除ROS積累可賦予植物對非生物脅迫的耐受性［64］。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）是植物體內重要的內源性抗氧化酶。bHLH家族中有部分基因被證明在冷應激中能提高SOD、POD或CAT的表達水平及活性使植物具有更強的冷適應能力。香蕉MaMAPK3與bHLH蛋白MaICE1相互作用，活化的MAPK3促進ICE1的表達，從而促進了過氧化物酶基因MaPOD P7的表達［30］。在杭菊中，過表達CmICE2的植株脯氨酸含量、SOD、POD和CAT活性增加，通過這些基因調控網絡和ROS清除機制，CmICE2賦予擬南芥自由耐受性［26］。在煙草中，NtbHLH123的過表達增強了轉基因煙草的耐寒性，研究發現NtbHLH123通過促進NtCBF的表達，以及提高一些非生物脅迫應答基因的表達來介導ROS清除能力和其他脅迫耐受途徑兩方面來提高脅迫耐受性［46］。枸桔的PtrbHLH與POD基因啟動子區E-box順式作用元件結合，過表達PtrbHLH株系具有較高的POD活性，積累較少的過氧化氫（H2O2），對氧化脅迫表現出較好的耐受性，且增強了其在低溫或冷凍條件下的耐寒性；而RNA干擾（RNAi）株系在低溫脅迫下POD活性較低，H2O2含量較高，低溫的敏感性升高［50］。橙子CsbHLH18基因在煙草中過表達后，POD、SOD和CAT的活性與抗氧化基因Nt-SOD、NtPOD和NtCAT的表達水平均有明顯提高，然而有趣的是，CsbHLH18缺乏與CsSOD和CsCAT基因啟動子之間的相互作用，只能夠與CsPOD啟動子結合并激活［29］。He等［37］也發現了橙子CsPIF8與CsPOD基因啟動子的結合作用，調節SOD的表達水平和活性以提高抗寒能力，并根據其N端的APB（active phytochrome-binding domain）基序猜測CsPIF8可能與PHY B相互作用來調控這一途徑。擬南芥中AtPIF3響應低溫反應的負調節因子，抑制CBF基因的表達，在低溫脅迫下，兩個能夠定向降解AtPIF3的F-box蛋白BINDING F BOX PROTEIN 1（EBF1） 和 BINDING F BOX PROTEIN 2（EBF2）自身被降解，增強了PIF3蛋白的穩定性，對擬南芥的低溫耐受力產生抑制作用；另一方面，光敏色素B（phyB）通過感知光和環境溫度信號來調節植物生長，冷誘導的AtCBF蛋白通過與AtPIF3相互作用并抑制PIF3-phyB模塊的協同降解來減輕這種抑制［34-35］。水稻OsPIL16與OsDREB1B基因啟動子的N-box區域結合，增加植株抗凍性，OsPIL16能夠被感受紅光的PHY B所抑制，因此PHY B突變體會表現出OsDREB1B水平上調、丙二醛濃度降低以及細胞膜完整性增加的冷耐受力增強的表型［36］。番茄中低紅光/遠紅光（L-R/FR）和低溫通過PHY A誘導SlPIF4的積累，而PHY B抑制低溫脅迫下SlPIF4的積累，SlPIF4不僅直接激活CBF的表達，而且與SlGAI4基因的啟動子結合并激活其轉錄物，從而促進脫落酸（ABA）和茉莉酸（JA）的生物合成和CBF的表達，SlGAI4誘導的ABA和JA信號通過調節CBF依賴或CBF非依賴途徑增強植物的耐寒性，而當大量的SlGAI4蛋白在冷應激期間積累時，它會以負反饋的方式抑制SlPIF4的積累［38］。低溫可在儲存的植物產品中誘發其木質化，對果實質量產生不利影響，Xu等［39］發現枇杷EjbHLH1表達與低溫誘導的果實木質化呈負相關，進一步研究發現，EjbHLH1與AP2/ERF蛋白 EjAP2-1、MYB家族蛋白EjMYB2形成三元復合物增強對木質素生物合成相關基因4-coumarate：coa ligase 1（Ej4CL1）啟動子的抑制。

4 小結

冷害、凍害給植物尤其是農作物帶來許多不利的影響，如生長發育緩慢、產量降低、形態改變，甚至導致植物死亡。眾多轉錄因子被證明參與植物對低溫脅迫的響應，隨著植物分子生物學的不斷發展，bHLH家族轉錄因子不斷地被鑒定，它們在植物非生物脅迫方面的功能和機制越來越多地被發掘出來。近年來，許多作物和園藝植物參與低溫應答的bHLH家族轉錄因子被鑒定，大部分通過CBF-COR途徑或是提高ROS清除能力來增強植物的低溫耐受力，有一部分bHLH轉錄因子能夠整合光信號、激素信號與低溫信號。雖然bHLH家族蛋白在植物低溫脅迫方面的研究已有較多成果，但對于多種植物來說，該家族蛋白響應低溫的機制仍舊不夠完善，與其他信號網絡的關聯機制還比較模糊，未來需更加深入地探索bHLH家族轉錄因子在低溫以及其他非生物脅迫方面的功能與機制。