不同相思樹種根際與非根際土壤細菌群落結構及多樣性特征

劉 芳，袁宗勝，曾志浩，林鴻艷，周麗麗，潘 輝*

（1.福建農林大學 生命科學學院，福建 福州 350002；2.閩江學院 海洋研究院，福建 福州 350108）

根際是植物進行正常生長發育，與植物根系緊密相關，并與微生物群系共同構成的一個復雜的生態區系，植物通過根際與外界環境進行物質與能量交換，根際微生物所形成的微生物環境對植物生長起到極其重要的作用［1－2］。植物根系和微生物之間的作用是相互的，根際微生物能夠通過促進植物對營養的吸收以及直接的作用促進植物生長發育，根際微生物群落的結構組成和功能多樣性受土壤類型、植物基因型、根系分泌物及植物生長周期等因素的影響［3－4］。多位學者已對土壤細菌群落結構、土壤微生物的作用，以及土壤微生物、植物群落及土壤特征之間的關系等進行了研究［5-8］。研究表明，根際微生物群落結構和多樣性影響植物的生長發育，同樣，植物類型的多樣性也會影響根際微生物群落的結構［9-11］。

相思類樹種是常綠喬木，屬含羞草科（Mimosaceae）金合歡屬（Acacia Wild）。研究表明，相思類樹種生長迅速、萌生能力強、根系發達，耐貧瘠、鹽堿和干旱，是沿海地區沙質土壤更新造林的理想樹種［12］。許多林學專家及林業工作者已開展了相思樹的引種、栽培技術及經營管理等方面的研究［13-14］。開展相思樹根際與內生微生物群落結構差異性以及關鍵微生物功能的研究，對于充分發揮相思樹種的改良土壤、維持地力、保持水土等生態功能具有重要的意義。

本文利用Illumina NovaSeq高通量測序技術，對福建省漳浦中西國有林場的不同相思樹種（以同一生境的桉樹為對照）的根際和非根際土壤細菌群落的多樣性特征進行了分析，以期為相思樹內生功能菌株的挖掘和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采樣地設在中國福建省漳浦中西國有林場，該區屬亞熱帶季風氣候，地理坐標為117°56′E、24°28′N，年平均氣溫21.8 ℃，年降水量1600 mm。在2019年11月，分別采集厚莢相思、卷莢相思、黑木相思、直干相思、馬占相思等樹種的根際土壤及非根際土壤樣本。

土壤樣本采集：隨機選取健壯植株，在距樹干1 m左右的位置用鐵鏟挖取50~60 cm深的樹根，將樹根取出，并選取黏在根上粒徑小于1cm的土壤作為根際土壤樣本，選取離植株根部30 cm以外的土壤作為非根際土壤樣本。采集樣本后立即將其放入無菌樣本袋中，在24 h內置于-20 ℃保存。本研究共采集樣本30個，每組3個樣本，樣本編號分別為厚莢相思根際土壤（HJ.D）和非根際土壤（HJ.E）；卷莢相思的根際土壤（JJ.D）和非根際土壤（JJ.E）；黑木相思的根際土壤（HM.D）和非根際土壤（HM.E）；直干相思的根際土壤（ZZ.D）和非根際土壤（ZZ.E）；馬占相思的根際土壤（MZ.D）和非根際土壤（MZ.E）。

1.2 樣本基因組DNA的提取及高通量測序

采用試劑盒TIANGEN Plant Genomic DNA kit（50）DP305-02并按照其說明書的步驟提取樣本基因組DNA。采用瓊脂糖電泳檢測基因組DNA的濃度和純度。將檢測合格的DNA進行PCR擴增，形成測序文庫［15］，并將質檢合格的文庫在Illumina NovaSeq PE250測序平臺進行高通量測序（由北京諾禾致源科技股份有限公司完成）。

1.3 數據分析

對測序得到的雙端Reads （PE Reads）進行拼接、過濾，除去嵌合體序列，最終得到有效數據（Effective Tags）。在97%相似度水平下對有效數據進行聚類分析，獲得OTU（分類操作單元）。采用RDP Naive Bayesian Classifier分類算法進行注釋。使用BioVenn在線軟件進行Venn圖繪制；使用Qiime軟件計算觀測物種數、Chao指數、Shannon指數等，分析不同相思樹種根內生細菌群落的結構特征及差異［16-18］。

2 結果與分析

2.1 測序結果及OTU分析

經測序分析，30個相思樹樣本序列長度在61029~90690條，總有效數據為2314745條。根據相似度在97%以上的序列聚類為1個OTU的原則進行有效OTUs統計，從圖1的稀釋曲線可以看出，當樣本測序深度達15000條時，稀釋曲線都趨于平緩，表明本次測序深度足以可靠地描述與樣本相關的細菌群落。

圖1 相似度為97%水平下的稀釋曲線

Venn圖可用于統計多個樣本共有和特有的OTU數目，能比較直觀地展現樣本的OTU數目組成相似性及重疊情況。圖2為不同相思樹種根際和非根際細菌OTUs的Venn圖。從不同樣本來源來看，不同相思樹種根際土壤樣本細菌的OTU數目表現為黑木相思＞直干相思＞馬占相思＞卷莢相思＞厚莢相思；不同相思樹種非根際土壤樣本細菌的OTU數目表現為厚莢相思＞直干相思＞黑木相思＞馬占相思＞卷莢相思。不同相思樹種同一來源土壤樣本細菌的OTU數目未呈現出完全一致的變化趨勢，但總體上表現為根際樣本＞非根際樣本。

圖2 不同相思樹種根際、非根際共有的細菌OTUs數量

5種不同相思樹種根際土壤樣本有683個共有OTUs，厚莢相思、卷莢相思、黑木相思、直干相思及馬占相思獨有的OTUs數分別為115、91、212、166及180個。5種不同相思樹種非根際土壤樣本有651個共有OTUs，厚莢相思、卷莢相思、黑木相思、直干相思及馬占相思獨有的OTUs數分別為128、81、151、145及168個。

2.2 細菌多樣性分析

Alpha多樣性分析可以反映樣本細菌群落的多樣性和物種豐度， ACE和Chao1指數能反映物種的豐富度，香農（Shannon）指數和辛普森（Simpson）指數能反映物種的多樣性。ACE和Chao1指數數值越大，說明根內生細菌的數量越多；香農指數和辛普森指數數值越大，說明根內生細菌的多樣性越高。由表1可知：不同相思樹種根際土壤細菌數量的排序為黑木相思＞馬占相思＞直干相思＞卷莢相思＞厚莢相思；不同相思樹種根際土壤細菌多樣性的排序為黑木相思＞卷莢相思＞直干相思＞馬占相思＞厚莢相思；不同相思樹種非根際土壤細菌數量的排序為厚莢相思＞黑木相思＞直干相思＞馬占相思＞卷莢相思；不同相思樹種非根際土壤細菌多樣性的排序為厚莢相思＞直干相思＞黑木相思＞馬占相思＞卷莢相思。由此可知，在不同相思樹種的根際土壤樣本中，黑木相思根際土壤細菌的豐富度和多樣性最高，同一相思樹種根際土壤細菌的豐富度和多樣性的變化規律相同。在不同相思樹種的非根際土壤樣本中，厚莢相思非根際土壤細菌的豐富度和多樣性最高，同一相思樹種非根際土壤樣本細菌的豐富度和多樣性的變化規律不同。相同相思樹種根際土壤細菌的豐富度和多樣性均高于非根際土壤細菌的。

表1 不同土壤樣品的測序統計結果與Alpha多樣性指數

2.3 細菌群落結構分析

比較了不同相思樹種根際和非根際細菌群落在綱水平上的相對豐度，結果如圖3所示，各樣本中占據主導地位的細菌群落均為Acidobacterlia和Alphaproteobacteria，其次為Gammaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria。其中，Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria在同一相思樹種根際土壤樣本中所占豐度均高于非根際土壤樣本，Acidobacterlia在同一相思樹種非根際土壤樣本中所占豐度均高于根際土壤樣本。

圖3 不同相思樹種土壤細菌群落在綱水平上的相對豐度

從圖4可以看出，不同相思樹種土壤樣本在目水平上的優勢菌群存在較大差異。通過比較不同樹種根內生細菌群落豐度比例可知，在不同相思樹種的根際土壤和非根際土壤樣本中，Acidobacteriales占主導地位，其次為Rhizobiales、unidentified_Gammaproteobacteria、unidentified_Alphaproteobacteria和Frankiales。在相同相思樹種的根際土壤樣本中Acidobacteriales、Rhizobiales、unidentified_Gammaproteobacteria和Frankiales的群落豐度均高于非根際土壤樣本中的。Xanthomonadales在卷莢相思、黑木相思和直干相思根際土壤樣本中的群落豐度均高于厚莢相思、馬占相思及不同相思樹種非根際土壤樣本中的。不同相思樹種根際和非根際土壤細菌群落在目水平上的相對豐度存在差異。

如圖5所示，10組土壤樣本的細菌群落豐度居前10的科主要包括Xanthobacteraceae、Beijerinckiaceae、Enterobacteriaceae、Pseudonocardiaceae、Burkholderiaceae、unidentified_Gammaproteobacteria、Pseudomonadaceae、unidentified_Acidobacteriales、Caulobacteraceae、Acidothermaceae。通過比較不同相思樹種根內生細菌在科水平上的群落豐度比例可知， Xanthobacteraceae、Acidothermaceae、unidentified_Acidobacteriales在不同相思樹種的根際土壤及非根際土壤樣本中均占優勢。同一相思樹種根際土壤樣本的細菌豐度均高于非根際土壤樣本的；不同相思樹種根內生細菌群落在科水平上的相對豐度存在差異。

圖5 不同相思樹種土壤細菌群落在科水平上的相對豐度

3 結論與討論

由于不同樹種的根部具有不同的吸收營養和分泌物質的能力，同時植物的根狀體沉積和根分泌物能促進根際土壤和根平面的化學吸引和定殖，所以形成了獨特、高度豐富和多樣的根際微生物群落［19-25］。筆者的研究表明：不同相思樹種在根際細菌群落的差異性。

已有研究表明，土壤根系富集的微生物在植物的生長發育過程中扮演著非常重要的角色，包括增強植物的抗逆性、促進對營養的吸收，以及響應植物的周期性［26］。Smalla等對馬鈴薯等作物根際微生物群落結構的研究表明，根際微生物群落結構和多樣性影響植物的生長發育，同樣，植物類型的多樣性也會影響根際微生物群落結構［5］。

植物與微生物的互作是近年來微生物學研究的新熱點，通過系統了解植物和微生物的功能和作用機制，研究植物在不同生長階段與微生物之間的相互作用，對提高植物的生產力，提高農作物的產量和品質，開發有益的微生物進行可持續的農林業生產具有重要的實踐意義［27］。