早期母愛剝奪影響邊緣系統-丘腦-皮質環路致大鼠成年后抑郁的機制研究

潘楠楠 盧浩揚 周列民 寧玉萍 方子妍▲

1.廣州醫科大學附屬腦科醫院神經科腦電圖室，廣東廣州 510370；2.廣州醫科大學附屬腦科醫院藥學部，廣東廣州 510370；3.中山大學附屬第一醫院神經科，廣東廣州 510080；4.廣州醫科大學附屬腦科醫院研究所，廣東廣州 510370

抑郁癥是常見的精神心理疾病，據WHO 報道全球約有3.5 億抑郁癥患者[1]。抑郁癥機制的研究是目前精神心理疾病研究的重點問題。出生后3～4年內（對大鼠相當于出生后1～14 d） 是神經系統發育的關鍵時期，研究證實在這個時期經歷持續應激，對其成年以后的行為及心理發育造成不利的影響[2]，精神心理疾病的易感性顯著增加[3]。研究發現早年應激（early life stress, ELS）可以增加成年后抑郁癥的患病風險[4]。本課題組前期研究發現大鼠出生后早期母愛剝奪可致成年后的抑郁樣行為，而這種行為的產生與母愛剝奪引起海馬各區神經元數目減少有關[5]。目前關于ELS致成年后抑郁癥易感性增加的機制尚不完全清楚，有研究者提出可能與ELS 造成大腦情感調節環路相關區域神經系統可塑性改變有關[6]。

邊緣系統-丘腦-皮質環路（limbic-thalamic-cortical, LTC）對情感調節和傳導具有重要作用，與情緒加工、記憶和控制網絡密切相關[7]。研究證據證實抑郁癥患者腦部的器質性病變主要定位于LTC 中[8]。本研究選用出生后早期母愛剝奪致抑郁大鼠模型為研究對象，采用盲法觀察早期母愛剝奪對成年大鼠前額葉、海馬區及丘腦神經元數目及星形膠質細胞表達的影響，驗證ELS 致大鼠成年后抑郁樣障礙中LTC 參與致病的現象，可望為臨床尋找抑郁致病機制提出病理生理方面的基礎證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 SPF 級SD 孕鼠購于廣東省動物中心[許可證號：SCXK（粵）2008-0002]。大鼠按照隨機數字表法分為母愛剝奪組（n=20）和對照組（n=20）。本實驗開始前獲得廣州醫科大學實驗動物倫理委員會批準。在整個實驗過程中采用盲法進行實驗操作：課題設計者對實驗動物及標本進行編號，并在整個實驗過程中保密，實驗操作者進行操作時隨機選取動物及標本。

1.1.2 儀器與試劑 恒冷箱冷凍切片機（Leica 公司，CM1800型）；光學顯微鏡（Olypus 公司，BX62）；兔抗大鼠Neun多克隆抗體（abcam 公司，ab177487）、小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體(abcam 公司，ab4648)、山羊抗小鼠IgG H&L(abcam 公司，ab150115)、 驢抗兔IgG H&L (abcam 公司，ab150073)。

1.2 實驗方法

1.2.1 母愛剝奪應激 母愛剝奪組大鼠從出生后第1天上午9:00～12:00 開始接受母愛剝奪：將母鼠從幼鼠籠移出，幼鼠籠放進30～34℃的恒溫箱內，分離結束后再將母鼠放回原來的幼鼠籠內，每日1 次，持續14 d。對照組大鼠不予以任何處理。

1.2.2 動物行為評估 兩組大鼠在飼養至2 個月齡時進行動物行為評估。評估內容具體如下。①糖水偏愛實驗。大鼠單籠飼養，給予相同的兩瓶清水，2 d 后，將清水替換為1%蔗糖水，2 d 后大鼠禁水16 h，后給予事先稱好重量的清水和1%蔗糖水各一瓶，分別放在之前相同位置，2 h 后將兩水瓶調換位置，4 h 后，取下瓶子稱重。計算各大鼠的蔗糖水飲用量及蔗糖偏愛率（蔗糖水飲用量/總飲水量×100%）。②社交實驗：將大鼠單獨放入有一只同性陌生大鼠的新籠內并開始計時，記錄大鼠放入到與陌生大鼠第一次主動互動的潛伏期(鼻子對鼻子互嗅或者鼻子嗅對方肛門，隨后爬到大鼠背上），用來表示大鼠社交活動主動性。

1.2.3 取材 大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4℃的生理鹽水經心臟沖洗后灌注4%多聚甲醛，取大腦經4%多聚甲醛后固定4～6 h，后依次經20%、30%蔗糖溶液梯度脫水，冰凍切片機冠狀位連續切片，片厚10 μm，每隔5 張取1 張腦片。置于-40℃冰箱備用。

1.2.4 Neun 免疫熒光染色 隨機取出冰凍切片，室溫下復溫，加0.3%TritonX-100，室溫孵育10 min，0.01 mol/L PBS 洗3 次；加封閉液，室溫孵育1 h；加單克隆小鼠抗大鼠Neun 抗體在4℃孵育16 h；0.01 mol/L PBS 洗3次，加二抗，室溫避光孵育1 h，0.01 mol/L PBS 洗3次；加封片劑封片；共聚焦顯微鏡400 倍鏡下觀察、拍照。使用ImageJ 軟件進行細胞計數分析。

1.2.5 GFAP 免疫熒光染色 隨機取出冰凍切片，室溫下復溫10 min，加0.3%TritonX-100，室溫孵育l0 min，0.01 mol/L PBS 洗3 次；加封閉液，室溫孵育1 h；加單克隆小鼠抗大鼠GFAP 抗體在4℃孵育16 h；0.01 mol/L PBS 洗3 次，加二抗，室溫避光孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗3次；加封片劑封片；共聚焦顯微鏡400 倍鏡下觀察、拍照。使用Image J 軟件進行細胞計數分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據分析，均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠成年后行為學評估結果

母愛剝奪組大鼠蔗糖偏愛率少于對照組大鼠，差異有統計學意義（P<0.05）；母愛剝奪組大鼠第一次主動與陌生大鼠互動潛伏期長于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。

表1 兩組大鼠成年后行為學評估結果（±s）

表1 兩組大鼠成年后行為學評估結果（±s）

母愛剝奪組（n=20）對照組（n=20）t 值P 值58.54±5.02 79.01±4.04 3.18 0.008 84.57±5.71 53.00±5.52 3.97 0.002組別 蔗糖偏愛率（%） 主動與陌生大鼠互動潛伏期（s）

2.2 大鼠前額葉、 海馬及丘腦Neun 免疫熒光染色計數神經元

兩組大鼠前額葉、 海馬及丘腦Neun 免疫熒光染色結果于400 倍鏡下拍照，使用Image J 軟件對相同部位進行細胞計數分析。計數結果示母愛剝奪組大鼠前額葉、 海馬及丘腦Neun 陽性神經細胞數少于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2、圖1（封三）。

圖1 Neun 染色結果

表2 兩組大鼠前額葉、海馬及丘腦Neun 染色陽性細胞計數結果（個，±s）

表2 兩組大鼠前額葉、海馬及丘腦Neun 染色陽性細胞計數結果（個，±s）

母愛剝奪組（n=20）對照組（n=20）t 值P 值22.35±2.71 31.24±5.49 6.25＜0.001 119.90±10.84 139.55±6.79 7.13＜0.001 32.14±5.31 40.60±6.88 5.01＜0.001images/BZ_15_212_2179_1205_2234.png

2.3 大鼠前額葉、 海馬及丘腦區GFAP 免疫熒光染色結果

兩組大鼠前額葉、海馬及丘腦GFAP 免疫熒光染色結果于400 倍鏡下拍照，計數GFAP 染色陽性的星形膠質細胞細胞數，結果顯示，母愛剝奪組大鼠前額葉、海馬及丘腦GFAP 染色陽性的星形膠質細胞少于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3、圖2（封三）。

表3 兩組大鼠前額葉、海馬及丘腦GFAP 染色陽性結果（個，±s）

表3 兩組大鼠前額葉、海馬及丘腦GFAP 染色陽性結果（個，±s）

母愛剝奪組（n=20）對照組（n=20）t 值P 值8.60±2.33 11.40±2.48 4.99＜0.001 13.10±2.17 19.70±2.20 10.08＜0.001 10.55±1.36 16.76±2.76 8.40＜0.001images/BZ_15_1275_334_2268_389.png

圖2 GFAP 熒光染色結果

3 討論

抑郁癥患病率、致殘率高，給患者及其家屬、社會帶來嚴重的危害和經濟損失[9]。大量研究發現出生早期發育階段的持續性應激事件可以損害大腦的結構和功能[5，10]，使其在成年后個體患抑郁癥風險明顯升高[11]。目前關于出生后早期應激事件增加成年后患抑郁癥風險的發病機制尚不清楚，深入探討早期母愛剝奪致成年后患抑郁癥風險增加的病理機制，對于預防抑郁癥具有重要的意義。

早年應激可引起的不同腦區的功能障礙，最早引起人們注意是前額葉在早期應激中的作用，后來人們逐漸發現前額葉與多個腦功能區通過雙相聯系在應激的易化負反饋抑制通路中發揮作用，這些腦區包括邊緣系統及丘腦等[12]。研究發現早期應激與前額葉、海馬等多個腦區體積減小相關[13]，經歷早期應激的抑郁癥患者其海馬體積較沒有經歷早期應激的抑郁癥患者顯著減小[14]。有研究者提出早年應激或許是抑郁癥的獨立性危險因素，且與抑郁癥患者大腦多個腦區的器質性異常有關[15]。

近年來研究證實抑郁癥也與不同腦區、多個網絡系統結構和功能改變有關聯[16]，這些器質性病變主要集中在LTC 上。前額葉、海馬、丘腦是LTC 的重要節點，在情緒調節和傳導中具有重要的作用[17]。前額葉與情緒、記憶及執行能力等密切相關，前額葉功能異常會影響情緒、認知及行為的調節，前額葉的這種調節異常被認為是抑郁癥診斷中情緒、認知及行為癥狀的核心機制[18]。海馬區是參與情緒記憶的重要腦區，也是前額葉皮質功能的重要調節器，海馬功能的異常可能與抑郁癥中常見的應激調節異常、 注意力不集中及記憶障礙相關。丘腦是大腦功能信息進行整合的重要腦區，通過不同的通路與不同腦區進行聯系，在情緒處理、認知及記憶中具有重要作用。大量研究發現前額葉、海馬、丘腦在抑郁癥患者存在明顯的活動異常[19-20]。

星形膠質細胞在中樞神經系統相關疾病中具有極其重要的作用，其與抑郁癥的關系也逐漸被研究者發現。有研究者提出“三重突觸”概念，認為星形膠質細胞是構成突觸的第三成分，參與調節神經元的興奮[21]。星形膠質細胞與超過90%谷氨酸重吸收和代謝有關[22]。星形膠質細胞功能障礙會造成神經元的損傷，造成神經元的丟失[22]。

本研究通過早期母愛剝奪建立大鼠抑郁模型，在經過14 d 早期母愛剝奪應激后，大鼠成年后的其行為學明顯出現快感缺失、社交回避等表現，很好的模擬了人類的抑郁癥狀，成功建立了早期母愛剝奪致成年大鼠抑郁模型。為進一步了解早期母愛剝奪致大鼠成年后抑郁的病理機制，本研究通過Neun 免疫熒光染色來標記神經元，采用GFAP 免疫熒光染色來計數星形膠質細胞數目，觀察早期母愛剝奪對成年大鼠前額葉、 海馬及丘腦神經元及星形膠質細胞數量的影響。結果發現早期母愛剝奪組大鼠前額葉、海馬區神經元及GFAP 陽性細胞數顯著少于對照組，這與之前他人的研究一致[23-24]。在實驗中還觀察了出生后早期母愛剝奪對丘腦神經元及星形膠質細胞數目的影響，發現母愛剝奪組大鼠丘腦神經元及GFAP 陽性細胞數目較對照組也顯著減少。因此本研究推測早年母愛剝奪應激對大鼠前額葉、海馬及丘腦區神經元及星形膠質細胞均造成嚴重的損傷，使其數目顯著減少，從而影響其正常功能，致使LTC 結構和功能出現異常，從而構成大鼠成年后出現抑郁樣行為學改變的病理基礎。

綜上所述，早期母愛剝奪可致LTC 重要組成部分前額葉、 海馬及丘腦區的神經元及星形膠質細胞數目顯著減少，推測LTC 可能是參與早年應激致成年后抑郁的重要病理機制。但本研究僅觀察了前額葉、 海馬、 丘腦區神經元及星形膠質細胞數目的改變，其具體的分子及信號機制尚不清楚，后續還需進一步研究。