基于環(huán)境因子與化學(xué)成分關(guān)聯(lián)的遼產(chǎn)道地藥材龍膽分布適宜性分析及區(qū)劃研究△

陳吉祥，尹海波，王丹，賈丁丁，賈春雷，程世贊

遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116000

遼寧省是龍膽的道地產(chǎn)區(qū)，為“遼藥六寶”之一。龍膽作為中醫(yī)臨床常用藥材，具有瀉肝膽實(shí)火功效，需求量較大。市場(chǎng)上流通的龍膽主要源于栽培品。生態(tài)環(huán)境差異會(huì)導(dǎo)致龍膽有效成分含量不同，不同地區(qū)龍膽品質(zhì)存在差異，研究龍膽在遼寧省內(nèi)品質(zhì)區(qū)劃對(duì)其合理種植及品質(zhì)提升非常重要。中藥龍膽為龍膽科（Gentianaceae）植物龍膽Gentiana scabraBge、條葉龍膽G.manshuricaKitag.、三花龍膽G.trifloraPall.或滇龍膽G.rigescensFranch.的干燥根莖及根，前3 種主要分布在遼寧、吉林、黑龍江和內(nèi)蒙古，商品名為“關(guān)龍膽”。通過(guò)實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，東北有大面積的種植龍膽，而遼寧省種植品種為龍膽G.scabraBge.，占“關(guān)龍膽”市場(chǎng)份額的80%以上，故本研究以遼產(chǎn)龍膽G.scabraBge.為研究對(duì)象。

中藥龍膽功效豐富，1 種成分無(wú)法評(píng)價(jià)其質(zhì)量，故選取環(huán)烯醚萜苷類成分龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷，龍膽多糖和龍膽堿5 種成分作為其品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)。多糖具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化作用；獐牙菜苦苷在植物內(nèi)生真菌和人體腸內(nèi)菌作用下轉(zhuǎn)化成龍膽堿發(fā)揮抗糖尿病作用；有研究猜測(cè)龍膽苦苷發(fā)揮作用也與龍膽堿的轉(zhuǎn)化有關(guān)，故龍膽堿也作為龍膽品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)[1]。

氣候和環(huán)境因素（降雨量、溫度、土壤類型、植被類型等）是影響物種分布的決定性因素，也決定了藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量[2-3]。通過(guò)實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同引種地的龍膽產(chǎn)量和質(zhì)量差異較大。冗余分析法（RDA）是多元回歸分析的直接擴(kuò)展，用于多變量響應(yīng)數(shù)據(jù)建模[4]。RDA 的優(yōu)點(diǎn)是可以檢測(cè)環(huán)境因子、樣地、化學(xué)成分三者之間的關(guān)系或兩兩之間的關(guān)系。本研究利用最大熵（MaxEnt）模型和ArcGIS 軟件，對(duì)龍膽潛在適宜區(qū)進(jìn)行分析，探討其主要生態(tài)因子的適宜范圍。深入分析環(huán)境因子與有效成分、有效成分與樣地之間的關(guān)系，為基于某種化學(xué)成分含量的龍膽栽培區(qū)域選擇和基于氣候環(huán)境的龍膽資源開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)，有利于推動(dòng)龍膽的合理種植、提高藥材的質(zhì)量。

1 材料

1.1 樣品

通過(guò)查閱《中國(guó)植物志》《遼寧植物志》等相關(guān)資料、實(shí)地調(diào)查和參考第四次中藥資源普查數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)在遼寧省內(nèi)龍膽G.scabraBge.主要分布在遼寧省的東部地區(qū)，遼西沒(méi)有發(fā)現(xiàn)野生及栽培龍膽。本課題組于2020 年赴本溪市南芬區(qū)、蓋州市、桓仁縣、寬甸縣、清原縣、西豐縣、新賓縣、岫巖縣、莊河市等遼寧龍膽主要產(chǎn)區(qū)進(jìn)行實(shí)地采樣，共獲取23 批樣品，均為3 年生龍膽。由全球定位系統(tǒng)（GPS）定位儀和軌跡儀實(shí)時(shí)獲取采樣點(diǎn)經(jīng)緯度、海拔等信息（表1）。樣品經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定為龍膽Gentiana scabraBge.。

表1 遼寧省龍膽樣品信息

1.2 儀器

1260 型高效液相色譜儀［配備二極管陣列（DAD）檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司］；UV-5200 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；PT-35SL 型微量電子天平（華志電子科技有限公司）；KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試藥

對(duì)照品龍膽苦苷（批號(hào)：R20O8F46237，純度：98%）、獐牙菜苷（批號(hào)：P31M7F12286，純度：98%）、獐牙菜苦苷（批號(hào)：Y25J10H91429，純度：98%）、秦艽甲素（批號(hào)：X31O9L73842，純度：98%）、α-D-無(wú)水葡萄糖（批號(hào)：M15M9E56052，純度：99%）均購(gòu)自上海源葉生物生物科技有限公司；甲醇（色譜純，默克股份有限公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 環(huán)境因子數(shù)據(jù)

環(huán)境因子數(shù)據(jù)來(lái)源于中藥資源空間信息網(wǎng)格數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.tcm-resources.com/）和采樣地氣象站，包括地形、土壤、溫度、降水情況及綜合氣象數(shù)據(jù)。

2.2 化學(xué)成分的檢測(cè)

采用參考文獻(xiàn)［5］方法測(cè)定龍膽中環(huán)烯醚萜苷類成分龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷含量；龍膽堿采用參考文獻(xiàn)［6］的方法進(jìn)行含量測(cè)定；龍膽多糖采用參考文獻(xiàn)［7］的方法，利用苯酚-硫酸法顯色，491 nm處進(jìn)行紫外-可見(jiàn)分光光度測(cè)定。

2.3 主成分分析（PCA）

主成分得分（ZF）是衡量質(zhì)量的重要參數(shù)，得分越高，質(zhì)量越好。利用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件的主成分分析方法，通過(guò)降維和賦予權(quán)重把5 種化學(xué)成分指標(biāo)轉(zhuǎn)化為1 個(gè)新的獨(dú)立綜合指標(biāo)，包含原始變量絕大部分信息，對(duì)龍膽的質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。把ZF 作為綜合評(píng)價(jià)龍膽質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，不但克服了確定權(quán)重不合理的缺陷，又可消除評(píng)價(jià)因子之間的相關(guān)影響[8-9]。

基于Kaiser-Harris 準(zhǔn)則保留特征值＞1 的主成分，故保留2 個(gè)主成分，前2 個(gè)成分包含了原始5 種成分74.807% 的信息（表2）。第一主成分（F1）主要反應(yīng)龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龍膽堿的信息；第二主成分（F2）主要反應(yīng)龍膽多糖的信息。ZF 反映了化學(xué)成分的協(xié)調(diào)程度[10-11]，在SPSS 中以2 個(gè)主成分因子得分各自的權(quán)重作為評(píng)估參數(shù)，計(jì)算公式為ZF=0.707 8F1+0.292 2F2。

表2 龍膽5種成分的主成分分析初始統(tǒng)計(jì)值

2.4 生態(tài)適宜性分析

基于采樣點(diǎn)數(shù)據(jù)，利用MaxEnt 模型和ArcGIS軟件相結(jié)合，得出龍膽分布概率。將轉(zhuǎn)換格式后的經(jīng)緯度信息與生態(tài)因子導(dǎo)入到MaxEnt 模型，參數(shù)設(shè)置隨機(jī)測(cè)試比例為15%，最大迭代運(yùn)算數(shù)為1×105次，其他參數(shù)為默認(rèn)值。模型預(yù)測(cè)結(jié)果精度評(píng)價(jià)以受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）為指標(biāo)，其越接近1 表示預(yù)測(cè)結(jié)果越可靠[12]。采用MaxEnt模型進(jìn)行迭代運(yùn)算，選取貢獻(xiàn)率大，權(quán)重高的生態(tài)因子為影響龍膽適宜性分布的主要生態(tài)因子，最后分析生態(tài)因子響應(yīng)曲線。

2.5 RDA

RDA 是一種結(jié)合回歸和PCA 的方法，利用Canoco 5.0 軟件進(jìn)行分析。典型相關(guān)分析（CCA）是研究2 組變量之間關(guān)系的一種多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，其基本原理是在每組變量中找出變量的線性組合，使其具有最大相關(guān)性，直到2 組變量之間的相關(guān)性被提取完畢[13-14]。以上過(guò)程在Canoco 5.0軟件中自動(dòng)進(jìn)行。對(duì)環(huán)境因子，龍膽5 種主要成分（龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龍膽多糖、龍膽堿）和ZF，以及樣地三者之間的關(guān)系進(jìn)行分析，找出最有代表性的環(huán)境因子，規(guī)劃最優(yōu)產(chǎn)區(qū)。

3 結(jié)果

3.1 龍膽主要有效成分含量測(cè)定及ZF

龍膽苦苷（C16H20O9）在《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版中為中藥龍膽定性定量鑒別中的指標(biāo)性成分，不得少于2.0%[15]。運(yùn)用2.2 項(xiàng)下方法測(cè)定有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（表3）。經(jīng)測(cè)定，遼寧省內(nèi)的龍膽龍膽苦苷含量全部符合要求，再次證明了遼寧省是龍膽道地產(chǎn)區(qū)，該產(chǎn)區(qū)所產(chǎn)龍膽質(zhì)優(yōu)效佳。運(yùn)用2.3項(xiàng)下的方法計(jì)算ZF（表3）。

表3 龍膽中5種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及ZF

3.2 分布區(qū)生態(tài)特征

采用AUC 進(jìn)行生境適宜度分析模型計(jì)算結(jié)果精度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖1。其訓(xùn)練集AUC為0.998，測(cè)試集的AUC 為0.994，表明龍膽生態(tài)適宜度的預(yù)測(cè)結(jié)果好，準(zhǔn)確度高。

圖1 龍膽生態(tài)適宜性分析ROC曲線

查閱《中國(guó)植物志》、實(shí)地調(diào)查和第四次中藥資源普查數(shù)據(jù)庫(kù)，現(xiàn)階段種植龍膽及野生龍膽集中在遼寧東部。與預(yù)測(cè)結(jié)果相同，龍膽在遼寧東部分布概率最大，如撫順市、丹東市、本溪市、鐵嶺市等，遼寧西部分布概率很小。根據(jù)MaxEnt模型計(jì)算分析的各生態(tài)因子在龍膽分布生境適宜度中所占權(quán)重可以看出，11 月降水量、11 月溫度、土壤質(zhì)地分類（USDA）、8 月降水量、最冷月最低溫、土壤類型、海拔所占權(quán)重方差貢獻(xiàn)率超過(guò)90%。通過(guò)分析主要環(huán)境因子響應(yīng)曲線可以看出，影響龍膽適宜性分布的主要生態(tài)因子最適宜值范圍。由圖2 可以看出，海拔在0～1400 m 分布概率最高，如繼續(xù)升高則分布概率急劇下降；最冷月最低溫在-30～-10 ℃分布概率最高；8 月降水量在200～400 mm 分布概率最高，少于200 mm時(shí)分布概率明顯下降；11月降水量在30 mm 左右分布概率最高，超過(guò)或不足30 mm 時(shí)分布概率下降；11 月溫度在-10～5 ℃分布概率最高。土壤最適質(zhì)地粉沙壤土，壤土；土壤最適類型為黑土、暗色火山灰土、石灰性黑土、鐵質(zhì)淋溶土。

圖2 影響龍膽生長(zhǎng)的主要環(huán)境因子響應(yīng)曲線

3.3 RDA關(guān)系排序分析

RDA 排序圖描述了有效成分和環(huán)境因子、有效成分和樣地之間的關(guān)系（圖3）。龍膽有效成分和ZF與環(huán)境因子的關(guān)系。箭頭越長(zhǎng)表示某一環(huán)境因子對(duì)龍膽有效成分含量的影響越大。可知最具有代表性的環(huán)境因子為經(jīng)度，其次為坡度、年均溫度、海拔、年均降水量、日照時(shí)數(shù)。

環(huán)境因子箭頭連線和龍膽有效成分含量夾角表示某相關(guān)性大小，夾角＜90°為正相關(guān)、＞90°為負(fù)相關(guān)，夾角越小相關(guān)性越高。結(jié)果表明，獐牙菜苷與經(jīng)度呈正相關(guān)，與坡度、年均溫度、海拔、年均降水量、日照時(shí)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與經(jīng)度相關(guān)性最大；獐牙菜苦苷與經(jīng)度、坡度、海拔、年均降水量呈正相關(guān)，與日照時(shí)數(shù)和年均溫呈負(fù)相關(guān)，與經(jīng)度相關(guān)性最大；龍膽苦苷與經(jīng)度、坡度、海拔、年均降水量呈正相關(guān)，與日照時(shí)數(shù)和年均溫呈負(fù)相關(guān)，與坡度和海拔相關(guān)性最大；龍膽堿與經(jīng)度、坡度、海拔、年均降水量呈正相關(guān)，與日照時(shí)數(shù)和年均溫呈負(fù)相關(guān)，與坡度相關(guān)性最大；龍膽多糖與日照時(shí)數(shù)和年均溫呈正相關(guān)，與經(jīng)度、坡度、海拔、年均降水量呈負(fù)相關(guān)，與日照時(shí)數(shù)相關(guān)性最大。ZF 與經(jīng)度、坡度、海拔、年均降水量呈正相關(guān)，與日照時(shí)數(shù)和年均溫呈負(fù)相關(guān)，與經(jīng)度相關(guān)性最大。

有效成分和樣地之間的關(guān)系。通過(guò)線性排序圖樣地在有效成分含量箭頭及其延長(zhǎng)線的投影點(diǎn)可以看出，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和龍膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5、6 號(hào)樣地（桓仁縣）豐度最高；獐牙菜苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2 號(hào)樣地（丹東市）豐度最高；龍膽多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20 號(hào)樣地（岫巖縣）豐度最高。ZF 在5、6 號(hào)樣地（桓仁縣）豐度最高。

3.4 基于分布適宜性分析和RDA 分析的品質(zhì)區(qū)劃研究

基于MaxEnt 模型和ArcGIS 相結(jié)合的分布適宜性分析可知龍膽在遼寧省的適宜分布區(qū)主要包括撫順市撫順縣、清原滿族自治縣、新賓滿族自治縣；本溪市本溪滿族自治縣、桓仁滿族自治縣；丹東市鳳城市、寬甸滿族自治縣；鞍山市海城市、岫巖滿族自治縣；大連市莊河市；鐵嶺市開(kāi)原市、調(diào)兵山市、鐵嶺縣、西豐縣、昌圖縣；營(yíng)口市蓋州市；遼陽(yáng)市燈塔市、遼陽(yáng)縣；盤(pán)錦市盤(pán)山縣。

RDA關(guān)系排序分析可知，ZF與經(jīng)度、海拔、年均降水量呈正相關(guān)，在適宜龍膽分布的前提下，數(shù)值越大，有效成分含量越高，品質(zhì)越好。故運(yùn)用ArcGIS 軟件將龍膽潛在分布圖層和海拔，年均降水量疊加，得出最優(yōu)產(chǎn)區(qū)。龍膽最優(yōu)產(chǎn)區(qū)主要分布在經(jīng)度較高的遼東地區(qū)，主要包括撫順市清原滿族自治縣南部地區(qū)；撫順市新賓滿族自治縣南部地區(qū)；撫順市撫順縣東南；本溪市本溪滿族自治縣中東部地區(qū)；本溪市桓仁滿族自治縣的中西部地區(qū)；丹東市寬甸滿族自治縣北部地區(qū)。除以上6 個(gè)分布較為集中的地區(qū)以外，還包括撫順縣、本溪市、岫巖滿族自治縣、鳳城滿族自治縣、西豐縣、蓋州市、營(yíng)口市、遼陽(yáng)縣、莊河市的小部分地區(qū)。

4 討論

產(chǎn)地環(huán)境因素是決定藥材是否適合引種栽培的決定性因素，也是影響藥材有效成分含量的重要因素。龍膽在遼寧省的栽培歷史悠久，是遼寧省的道地藥材。但并非全遼寧省都適合種植引種，地區(qū)之間質(zhì)量各異，因此研究環(huán)境因子、有效成分、樣地三者之間的關(guān)系有利于龍膽在遼寧省的合理種植開(kāi)發(fā)，節(jié)約資源。龍膽在遼寧省的分布主要集中在遼東，占90%以上，遼寧西部主要屬于溫帶大陸性氣候，氣候干燥，遼寧東部主要屬于溫帶季風(fēng)性氣候和少部分溫帶海洋性氣候（大連市、丹東市），氣候較濕潤(rùn)，因此氣候是影響龍膽分布的重要因素。對(duì)龍膽分布影響最大的生態(tài)因子主要有11 月降水量、11 月溫度、1 月溫度、USDA、8 月降水量、最冷月最低溫、土壤類型、海拔。遼寧省龍膽的花期在8—9 月份，8 月份降水量是影響龍膽開(kāi)花的重要因素，最適范圍在200～400 mm；10—11月為遼寧省龍膽的結(jié)果期，地上部分逐漸枯萎，11 月的溫度和降水量共同影響龍膽的結(jié)果，這個(gè)時(shí)期溫度的最適范圍-10～5 ℃，降水量在30 mm 左右，干燥涼爽，最冷月最低溫大約在-30～-10 ℃，氣溫寒冷有利于種質(zhì)保存與來(lái)年的萌發(fā)，這也與龍膽喜涼耐寒的生長(zhǎng)習(xí)性相吻合；粉沙壤土，土質(zhì)較疏松保水保溫，透氣性好；黑土、石灰性黑土、鐵質(zhì)淋溶土、主要分布在遼東半島及東北地區(qū)，土壤養(yǎng)分含量高。

RDA 可以對(duì)有效成分、環(huán)境因子、樣地三者進(jìn)行分析或兩兩分析。根據(jù)RDA 關(guān)系排序分析可知，對(duì)龍膽有效成分含量影響最具代表性的環(huán)境因子是經(jīng)度，其次為坡度、年均溫度、海拔、年均降水量、日照時(shí)數(shù)。龍膽的3 種環(huán)烯醚萜類成分龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷及龍膽堿的含量都與經(jīng)度呈正相關(guān)，經(jīng)度越大成分含量也越大，日照時(shí)數(shù)和年均溫是制約成分積累的關(guān)鍵因素。龍膽多糖相反，日照時(shí)數(shù)越長(zhǎng)、年均溫越高越有利于多糖的積累。ZF 衡量龍膽綜合品質(zhì)，與經(jīng)度、坡度、海拔、年均降水量呈正相關(guān)，與日照時(shí)數(shù)和年均溫呈負(fù)相關(guān)，與經(jīng)度相關(guān)性最大。遼東山區(qū)海拔高，經(jīng)度高，同時(shí)年均溫低，降水量豐富，氣候和環(huán)境因素有利于龍膽有效成分的積累，因此遼寧省龍膽的最優(yōu)產(chǎn)區(qū)主要分布在遼東地區(qū)。

遼寧省龍膽的區(qū)劃研究對(duì)于基于野生龍膽分布地區(qū)的栽培龍膽的開(kāi)發(fā)有指導(dǎo)意義，避免了盲目引種造成的資源浪費(fèi)，規(guī)劃最優(yōu)產(chǎn)區(qū)，引導(dǎo)農(nóng)戶合理選址種植。基于影響龍膽的分布適宜性的環(huán)境因子研究，利于根據(jù)相應(yīng)環(huán)境因子開(kāi)發(fā)適合龍膽種植的新區(qū)域；基于影響龍膽品質(zhì)的環(huán)境因子的研究，利于提高基于某一單一成分生產(chǎn)需要的龍膽種植，提高龍膽的總體質(zhì)量。