基于電子舌和多成分定量技術的厚樸“苦味”藥性物質基礎研究△

荊文光，趙小亮，張權，程顯隆，馬雙成*，魏鋒*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；

2.中國中醫科學院 醫學實驗中心，北京 100700

藥性是中藥的基本屬性，中藥藥性理論作為中醫藥理論的核心內容，是中藥發揮藥效作用的高度概括。利用現代科學技術挖掘中藥“四氣五味”的物質基礎，是闡述中藥整體藥效物質基礎的重要環節。《黃帝內經·素問》記載：“五氣入鼻、五味入口”[1]，說明中藥四氣五味的發現最先依賴于人的鼻舌，然而歷代醫家對于同一種藥物味的記述并不完全相同，且對藥味敏感度也不同，故有“極”“大”“甚”或“微”的描述[2]。近年來，隨著科學技術的進步，許多仿生模型被應用到食品和藥物的氣味鑒別及質量評價中，其中應用較多的有電子鼻和電子舌技術。與人工評價相比，電子舌具有客觀性，重復性，無需進行樣品前處理，不疲勞，檢測速度快，數據電子化、易存儲、易描述的優點。電子鼻、電子舌等現代仿生技術結合化學分離分析的方法為中藥藥性物質基礎的研究提供了客觀化、定量化的手段[3-6]。杜瑞超等[7]選取了5種苦味藥、6種甜味藥、6種酸味藥、6 種咸味藥，采用不同煎煮方法進行處理，利用電子舌檢測，并采用主成分分析和判別因子分析分別對原始數據進行處理，結果表明，相同味道的中藥能夠很好地聚類，建立的滋味區域能夠很好地辨別中藥的酸、苦、甜、咸。馬文鳳等[8]以延胡索為例探討仿生技術在中藥五味辨識研究中的應用，利用季銨堿型生物堿小檗堿及叔胺堿型生物堿延胡索乙素與構建的苦味受體hTAS2R10 結合，其對接分值較高，故認為延胡索藥材中的苦味物質基礎為叔胺堿型及季銨堿型化合物。梁曉光等[9]研究了苦味藥黃連的物質基礎，采用電子舌技術對色譜分離得到的6 個化合物進行苦度評價，并結合大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制實驗對結果進行相關性評價，發現除非洲防己堿外，苦度越大的成分抑菌效果越好，并進一步證實苦味化合物應為苦味藥的主要藥效物質基礎。曾燕等[10]采用電子舌技術考察不同來源黃芩藥材味覺信息和主要化學成分之間的相關性，黃芩的苦味、澀味、苦回味、澀回味、酸味與黃芩苷含量呈現顯著的正相關，說明黃芩苷為黃芩苦味的物質基礎。

厚樸始載于《神農本草經》，為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹葉厚樸M.offcinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮[11]。其性溫，味苦、辛，具有燥濕消痰、下氣除滿之功，用于治療濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘咳等[12]。化學成分研究表明，厚樸主要含有厚樸酚類、生物堿和苯乙醇苷類成分[13]。本實驗在前期建立厚樸中8個指標性成分含量測定方法工作的基礎上[14]，采用電子舌對厚樸苦味藥性進行定量化表征，并與其8 個成分含量進行相關性分析，闡述其苦味藥性的物質基礎。

1 材料

1.1 試藥

厚樸（編號：HP01～HP10）采自湖北恩施市華中藥用植物園，凹葉厚樸（編號：AY01～AY10）采自湖南永州道縣厚樸基地，所有樣品樹齡均約為20 年，均采自胸徑部位，經中國食品藥品檢定研究院魏鋒研究員鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.和凹葉厚樸M.offcinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮。

對照品紫丁香酚苷（批號：Y28M9H57297）、和厚樸酚（批號：T28O6B5149）、木蘭苷A（批號：X16S8L44141）、木蘭箭毒堿（批號：M29J8S40878）、厚樸酚（批號：KS0912CB14）、木蘭花堿（批號：R21M9F61834）均購自上海源葉生物科技有限公司；對照品木蘭苷B、辣薄荷基厚樸酚為實驗室自制；所有對照品經超高效液相色譜法（UPLC）峰面積歸一化測定，純度均大于98.0%；乙腈、甲醇（色譜純，Thermo Fisher公司）；純凈水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；氯化鉀、氫氧化鉀、酒石酸等其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

Waters ACQUITY H-Class 型超高效液相色譜，光電二極管陣列檢測器（PDA），Empower 3 工作站；AE 240 型十萬分之一電子天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TS-5000Z 型電子舌[日本Insent 公司，配備5 種基本味（酸、甜、苦、咸、鮮）和澀味的評價系統]。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為WatersACQUITYUPLC BEH-Cl8（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，9%～11%B；2～5 min，11%～12%B；5～8 min，12%～15%B；8～10 min，15%～39%B；10～13 min，39%～60%B；13～18 min，60%～65%B；18～24 min，65%～96%B；24～25 min，96%～100%B）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣體積：1.0 μL；檢測波長：木蘭箭毒堿為282 nm，紫丁香酚和木蘭花堿為260 nm，木蘭苷A和木蘭苷B為310 nm，和厚樸酚、厚樸酚和辣薄荷基厚樸酚為290 nm，色譜圖見圖1。

圖1 厚樸樣品和混合對照品色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

分別取對照品紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚適量，精密稱定，用甲醇配制成質量濃度分別為30.72、29.24、37.40、88.32、61.92、49.16、45.60、29.16 mg·L-1的混合對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取厚樸藥材粉末（過三號篩）0.3 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，冷浸24 h，用甲醇補足減失的質量，濾過，取續濾液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 分別精密吸取不同質量濃度的混合對照品溶液各1.0 μL 注入超高效液相色譜儀，按2.1 項下色譜條件采用不同波長測定，以紫丁香酚苷等8 個成分峰面積為縱坐標（Y），進樣質量為橫坐標（X）繪制標準曲線，8 個成分回歸方程、相關系數（r）、線性范圍、定量下限（LLOQ）和檢測下限（LLOD）見表1。結果表明，在定量范圍內各化合物的線性關系良好。

表1 厚樸中8個成分回歸方程、r及線性范圍、LLOQ和LLOD

2.4.2 精密度試驗 將混合對照品溶液連續進樣6 次，計算紫丁香酚苷等8個成分峰面積的RSD。結果顯示，紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚峰面積的RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度較好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液（HP05）分別于0、1、2、4、8、12、24 h進樣分析，計算紫丁香酚苷等8 個成分峰面積的RSD。結果顯示，紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚峰面積的RSD 均小于2.5%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批厚樸藥材樣品（HP05），按2.3項下方法操作，平行制備6份供試品溶液，在2.1 項下色譜條件下測定，用外標法計算各化合物的含量，并計算測定結果的RSD。結果顯示，紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚含量的RSD均小于2.0%，表明該方法重復性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的厚樸（HP05）樣品粉末0.1 g，平行制備6 份，按照100%分別加入8 個對照品，按2.3 項下方法制備樣品溶液，進樣分析，計算8 個成分的含量和加樣回收率。結果顯示，紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚平均回收率分別為100.1%、94.1%、98.5%、97.8%、96.1%、98.7%、99.0%、100.2%，RSD分別為3.02%、2.62%、3.30%、2.53%、2.36%、2.66%、2.42%、1.67%。

2.4.6 含量測定 按照2.3項下方法制備20批厚樸藥材樣品溶液，按2.1 項下色譜條件進行分析，分別測定紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚的含量（表2）。

表2 厚樸藥材中8個成分的質量分數（n=3）

2.5 厚樸藥材的電子舌味覺分析

精密稱取厚樸樣品1 g，精密加入去離子水（95～100 ℃）100 mL，超聲30 min（300 W，40 Hz），放冷，12 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），取上清液70 mL 進行測定，每份樣品平行測定4 次，取后3 次平均值，結果見表3。測試用液：參比溶液（人工唾液）為30 mmol·L-1KCl溶液和0.3 mmol·L-1酒石酸；負極清洗液為100 mmol·L-1HCl 和30%乙醇混合液；正極清洗液為100 mmol·L-1KCl、100 mmol·L-1KOH 和30%乙醇的混合液。其中，酸味（sourness）的無味點（tasteless）為-13.0，咸味（saltiness）的無味點為-6.00，其余味道的無味點均為0。

表3 厚樸藥材電子舌味覺測定（n=3）

2.6 厚樸藥材化學成分含量與電子舌味覺的相關性分析

為尋找厚樸苦味的藥性物質基礎，將厚樸藥材中8 個成分與苦味、苦味回味傳感器測定值進行皮爾遜（Pearson）相關性分析，結果厚樸酚、和厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚與苦味、苦味回味存在顯著的正相關（P＜0.05，P＜0.01），說明厚樸酚、和厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚為厚樸苦味的潛在物質基礎（表4）。木蘭箭毒堿與苦味、苦味回味存在顯著的負相關，此外木蘭花堿、木蘭苷A 未顯示與苦味有直接相關性，而與苦味回味存在負相關，可能這2個成分對苦味傳感器不敏感，這與梁曉光等[9]報道黃連中木蘭花堿苦度響應值較低相符合。

表4 苦味和苦味回味值與厚樸中8個成分含量相關性分析

2.7 厚樸藥材電子舌測試液中化學成分分析

由于電子舌測定溶液為樣品沸水溶液，厚樸酚、和厚樸酚等成分的水溶性較差，在溶液中質量濃度較低，為真實表征與味覺直接相關的化學成分，同時測定了20 個樣品電子舌測試液中8 個成分的質量濃度。取2.5 項下剩余離心上清液，放置至室溫，直接經0.22 μm 微孔濾膜濾過，進行UPLC 分析。由于辣薄荷基厚樸酚含量低于定量限，故只檢測剩余7個化學成分的質量濃度，結果見表5。

表5 厚樸藥材電子舌測試液中7個成分質量濃度

2.8 厚樸藥材電子舌測定液中化學成分與響應值的相關性分析

從測試液的成分和苦味、澀味的相關性上看（表6），雖然厚樸酚、和厚樸酚的含量較低，但是仍然與苦味、苦味回味有顯著的正相關，其結果和藥材中2 種成分與苦味、苦味回味的相關性結果一致。由此可知，厚樸酚、和厚樸酚可作為厚樸苦味藥性物質基礎。

2.9 6個指標性單體成分味覺測定

結合表4 和表6 結果，厚樸酚、和厚樸酚與苦味、苦味回味均具有顯著正相關。木蘭苷A、木蘭花堿和木蘭箭毒堿與苦味回味存在顯著負相關。木蘭苷B 未表現出明顯的苦味。由于厚樸飲片臨床多用湯劑，且湯劑中并未檢測辣薄荷基厚樸酚，因此，為驗證厚樸苦味藥性物質基礎，對厚樸酚、和厚樸酚、木蘭苷A、木蘭苷B、木蘭花堿和木蘭箭毒堿6個化學成分進行味覺測定。分別精密稱取一定量的6個化合物，用10%乙醇配制成3×10-4mol·L-1的溶液100 mL，取溶液80 mL 采用電子舌進行味覺分析。結果表明，6 個化合物基本不存在酸味和咸味，與藥材測定結果相同（表7）。其中，厚樸酚、和厚樸酚苦味和苦味回味響應值均為最高，結合藥材及測試液中厚樸酚、和厚樸酚的質量濃度分布情況，可認為厚樸酚、和厚樸酚為厚樸苦味的藥性物質基礎。

表6 苦味和苦味回味值與厚樸藥材電子舌測試液中7個成分質量濃度相關性分析

表7 厚樸中6個指標性單體成分電子舌味覺測定

3 討論

中藥藥性理論是中醫藥基本理論研究的分支，而藥性物質基礎研究是藥性理論研究的重點。采用多層次、多手段、多方法、多成分的整體研究方法能夠為中藥藥性物質基礎及中藥質量控制研究尋找到可靠的指標性成分。藥性功效的發揮依托藥材，而自然環境的變化影響藥材內部化學成分的變化，因此藥性物質基礎研究關鍵在于化學成分分析[15]。本實驗中測定的化學成分包含苯乙醇苷類化合物木蘭苷A、木蘭苷B，酚苷類化合物紫丁香酚苷，水溶性生物堿類化合物木蘭花堿、木蘭箭毒堿及木脂素類化合物厚樸酚、和厚樸酚，基本能夠涵蓋厚樸中主要化學成分類型。結果顯示，厚樸酚類成分是厚樸苦味的藥性物質基礎，這與《中華人民共和國藥典》2020 年版中以厚樸酚與和厚樸酚作為質量分析成分相一致。此外，厚樸酚可提高小鼠胃排空率及小腸推進率[16]，這與其苦味能泄、能燥的作用相符合。

厚樸基原有厚樸和凹葉厚樸2 種，有研究結果表明，厚樸酚、和厚樸酚、厚樸酚類總量、厚樸酚與和厚樸酚比例等品質性狀在種源間差異有統計學意義[17]。從道地產區和藥材品質上看，厚樸基原優于凹葉厚樸，本實驗為保證樣本的多樣性，樣品收集過程兼顧了以上2 種厚樸基原，同時保證采集年限和采集部位基本保持一致，結果比較苦味和苦味回味均值發現，厚樸響應值高于凹葉厚樸，這與厚樸中厚樸酚與和厚樸酚含量均值高于凹葉厚樸相一致，也從側面說明厚樸在苦味藥性上優于凹葉厚樸，質量較優。

厚樸含有揮發油類成分，其揮發油主要成分為β-桉葉醇，約占總揮發油的30%～40%，本課題組在前期工作中也測定了β-桉葉醇在厚樸藥材和飲片中的含量[18]，本實驗中將藥材中β-桉葉醇含量與其電子舌的響應值進行相關性分析，未發現其與所測的任何一種味覺有相關關系，故未納入統計分析，其作為揮發性成分可能為厚樸辛味的物質基礎。而在單體化合物的苦味測試中，2 種水溶性生物堿雖表現出一定的苦味，但是未表現明顯的苦味回味，反而澀味響應最好，說明厚樸刺激性來源可能為生物堿類成分。研究表明，厚樸姜炙后，厚樸酚類成分含量變化不明顯，生物堿類成分含量明顯下降，說明炮制主要影響其澀味，對苦味藥性影響不明顯[18]，但尚需實驗驗證。本實驗采用化學成分分析結合電子舌技術，初步揭示了厚樸苦味的藥性物質基礎，如能結合藥效學研究進行驗證，可為更多中藥藥性物質基礎的研究提供參考，能夠更深層地揭示中藥藥性理論的科學內涵，為中藥臨床使用和科學研究提供理論依據。