基于生物活性導向分離及灰色關聯度分析的山楂核干餾液抗炎和抗菌作用物質基礎研究△

張鷺，錢大瑋，唐志書*，宋忠興，王明耿，劉峰，陳衍斌，許剛，許洪波

1.陜西中醫藥大學 陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心/秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室（培育）/陜西中藥產業技術研究院，陜西 咸陽 712083；

2.南京中醫藥大學 江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇 南京 210023；

3.山東步長制藥股份有限公司，山東 菏澤 274000；

4.陜西國際商貿學院 陜西省中藥綠色制造技術協同創新中心，陜西 咸陽 712046

山楂核（山楂種子）是山楂加工業的主要副產品，占山楂果實干質量的30%。隨著山楂產品產量的增加，世界各地每年產出大量山楂核（僅中國每年就生產約150萬t）。化學成分研究結果表明，山楂核主要含有木脂素類成分，通過干餾技術可將山楂核中的木脂素等大分子裂解為大量酚類單體和低聚物，即干餾液[1]。前期關于山楂核干餾液的藥理作用研究表明，其具有顯著的抗炎及抗菌活性，已被開發成抗菌藥品（如紅核婦潔洗液）[2-3]，用于治療由白色念珠菌感染后引發的霉菌性陰道炎，臨床療效較好。

此前，研究者采用氣相色譜-質譜法（GC-MS）對山楂核干餾液的化學組成進行了分析，共鑒定了90 余個化合物，主要為小分子酚、醛、呋喃類[4-6]。目前，有關山楂核干餾液質量控制的指標性成分多選擇糠醛和愈創木酚[7]。前期研究表明，這2 個成分不是山楂核干餾液的特征性成分，同時其結構不穩定[8]。截至目前，山楂核干餾液抗炎和抗菌作用的物質基礎尚不明確。本研究通過建立山楂核干餾液4個流分的GC-MS 明晰其主要成分，并使用灰色關聯度分析法計算主要色譜峰與其抗炎、抗菌作用的關聯度，從而明確其發揮抗炎、抗菌作用的化合物，為山楂核干餾液的臨床應用及其相關產品質量標準的制定提供參考。

1 材料

1.1 細胞與菌株

小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 購自中國科學院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所；白色念珠菌（菌株編號：ATCC 10231）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器

5977-7890A 型氣相色譜-質譜聯用儀，HP-5MS型毛細管色譜柱均購自安捷倫科技有限公司；XS205DU 型十萬分之一電子分析天平（美國梅特勒-托利多儀器公司）；ICO240 型恒溫培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；HYQ240S 型全溫雙層搖床（中國常州愛華儀器公司）；Synergy?H1 型多功能微孔板檢測儀（美國伯騰公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州安泰凈化設備有限公司）；BX53F 型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；5804R型高速冷凍離心機（德國艾本德公司）。

1.3 試藥

山楂核購自山東步長制藥股份有限公司，并經過陜西中醫藥大學中藥鑒定教研室胡本祥教授鑒定為山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟種子。

RPMI 1640 培養基（批號：2049224）、胎牛血清（批號：2001003）、胰蛋白酶（批號：2043176）、磷酸鹽緩沖液（批號：2031104）均購于Biological Industries公司；酵母提取物（批號：20201118）、蛋白胨（批號：20200918）、麥芽提取物（批號：20200812）和葡萄糖（批號：20200918）均購自北京奧博星生物技術公司；兩性霉素B（AMB，批號：K1919038）購自阿拉丁試劑有限公司；N-硝基-L-精氨酸甲基酯鹽酸鹽（L-NAME，批號：WXBC9273V）和脂多糖（LPS，批號：L4391）來源于大腸桿菌0111：B4，購自Sigma 公司；正構烷烴混合對照品C8～C40（批號：E129360，美國Sigma-Aidrich公司）。

2 方法

2.1 山楂核干餾液的制備與分離

將山楂核1170 g 置于蒸餾釜中，升溫至150 ℃保持60 min，以除去水分和揮發性成分。之后，將溫度升至270 ℃，收集蒸餾出的液體產物（干餾液）300 g。取干餾液20 g，經D101型大孔吸附樹脂色譜柱分離，依次用體積分數為30%、50%、70%的甲醇水溶液和甲醇洗脫，得到4 個流分Fr.A（6 g）、Fr.B（4 g）、Fr.C（1.1 g）和Fr.D（3.3 g）。

2.2 細胞活力檢測

將對數生長期的RAW264.7細胞，以1×105個/孔接種于96 孔板中，放置培養箱孵育4 h 后，設置對照組、模型組、陽性藥（L-NAME）組、山楂核干餾液組及4 個流分組。對照組加入培養基；模型組加入終質量濃度為1μg·mL-1的LPS；陽性藥組加入L-NAME（終質量濃度為26～400 μg·mL-1的5 個梯度）和終質量濃度為1μg·mL-1的LPS；給藥組分別加入山楂核干餾液[0.1%二甲基亞砜（DMSO）稀釋使終 質量濃度 為3～240 μg·mL-1的7 個梯度]、4 個亞流分（0.1% DMSO 稀釋使終質量濃度為2～300μg·mL-1的8個梯度）和終質量濃度為1μg·mL-1的LPS。每個質量濃度設有3 個復孔，培養24 h。棄去上清液，加入噻唑藍（MTT）0.5μg·mL-1，孵育4 h；棄去上清液，加入DMSO 溶解后，用酶標儀于492 nm 檢測吸光度（A）并按照公式（1）計算細胞活性，空白中只加入了培養液。

2.3 一氧化氮（NO）檢測

LPS 刺激炎癥模型已被廣泛用于研究各種天然衍生物的抗炎活性。NO抑制作用已普遍用作抗炎效果的指標，L-NAME是精氨酸的類似物，能抑制NO產生，故用作陽性對照[9]。將RAW264.7 細胞以1×105個/孔接種于96 孔板中，培養過夜。將細胞與質量濃度均同2.2 項下的山楂核干餾液、L-NAME和4個流分孵育2 h，再加入終質量濃度為1 μg·mL-1的LPS 刺激處理20 h，每個質量濃度設有3 個復孔，采用Griess 法檢測細胞生成NO 的量，每組實驗重復3次。

2.4 抗菌活性測試

AMB 是多烯類真菌抗生素，其通過與真菌細胞膜中的麥角固醇結合，從而改變膜通透性來引起真菌生長停止或者死亡，對白色念珠菌有較強的抑制作用[10]，可作為抗菌作用的陽性對照。采用微量稀釋法測定AMB、山楂核干餾液和4 個流分的抗菌活性。設置對照組、陽性藥組、山楂核干餾液組及4個流分組。取制備好的菌懸液（5×106CFU·mL-1）100μL 分別加入96 孔板中，對照組加入培養基；陽性藥組加入AMB 終質量濃度為0.5～75.0 μg·mL-1的8 個梯度；給藥組分別加入山楂核干餾液和4 個亞流分（0.1% DMSO 稀釋使終質量濃度為0.16～23 mg·mL-1的8個梯度質量濃度），每個質量濃度設有3個復孔，在30 ℃下培養48 h。每孔加入MTT20μL，避光培養4 h，棄上清液，每孔再加入DMSO 150 μL，用酶標儀在492 nm 處測定A，以不加測試樣品組為空白對照，每組實驗重復3次，按公式（1）計算抗菌活性。

2.5 GC-MS分析

2.5.1 供試品制備 分別稱取Fr.A、Fr.B、Fr.C和Fr.D 各10 mg，分別置于4個10 mL量瓶中，再加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，制得質量濃度為1μg·mL-1的供試品溶液，過0.22μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.5.2 色譜條件 色譜柱為HP-5MS 型毛細管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為氦氣；體積流量為1.0 mL·min-1；進樣口溫度為250 ℃；檢測器溫度為300 ℃；進樣量為2 μL，不分流；升溫程序見表1。

表1 供試品GC-MS升溫程序

2.5.3 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；離子源溫度為250 ℃；四極桿溫度為150 ℃；溶劑延遲5 min；質譜掃描模式為全掃描；質量掃描范圍m/z45～650；所得數據經美國國家標準與技術研究所數據庫2014（NIST 2014）質譜數據庫檢索匹配，根據匹配度、保留指數及文獻已報道物質進行核對。保留指數（RI）的測定采用相同的氣相色譜條件測定正構烷烴（C8～C40）的保留時間，按公式（2）計算出4個流分中各揮發性化合物的RI。

tR（x）、tR（n）、tR（n+1）分別表示待測化合物，含碳數n和碳數n+1 的正構烷烴的保留時間且tR（n）＜tR（x）＜tR（n+1）。

2.6 灰色關聯度分析

2.6.1 原始數據的無量綱化處理 原始數據的變換采用均值變換法。變換的母序列記為{X0（t）}，子序列記為{Xi（t）}。將山楂核干餾液4 個流分的抗炎（抗菌）活性的藥效指標作為母序列，山楂核干餾液4個流分的特征峰峰面積作為子序列。

2.6.2 絕對差序列及關聯系數的計算 在t=k時（k為峰號），母序列記為{X0（k）}，子序列記為{Xi（k）}，按公式（3）計算母序列與子序列的絕對差序列Δ0i（k）。按公式（4）計算在t=k時母序列與子序列的關聯系數η（k）。

m為4個流分，Y0（k）為山楂核干餾液4個流分抗炎（抗菌）藥理藥效指標；Yi（k）為山楂核干餾液4 個流分各特征峰峰面積歸一化數值；k為峰號；ρ為分辨系數，作用是削弱最大絕對差數值的失真，提高關聯系數之間的顯著性差異，ρ∈（0，1），本實驗中ρ取0.5；∣Y0（k）-Yi（k）∣為母序列與子序列的絕對差值；|Y0(k) -Yi(k)|為絕對差值的最小值，又記為Δmin；Y0(k) -Yi(k)|為絕對差值的最大值，又記為Δmax。

2.6.3 關聯度的計算 按公式（5）計算關聯度（r），r是對時間序列幾何關系的比較，是母序列與子序列各個時刻的關聯系數的平均值，n為子序列的數據個數。

2.6.4 結果分析 通過Graph pad 8.0 統計學軟件處理數據。取4 個流分中化合物的含量為獨立變量，4 個流分的50%最低抑菌濃度（MIC50）作為因變量計算關聯度。如果灰色關聯度分析的值較低，則該化合物對白色念珠菌的MIC50較小，表明其可能具有較強抗菌活性。同理對其抑制NO 生成的活性結果進行分析。

3 結果

3.1 山楂核干餾液和4個亞流分的細胞活性

細胞活力測試結果（圖1）表明，當L-NAME質量濃度為269.70μg·mL-1時，與對照組比較，對LPS 刺激的RAW264.7 細胞造成的損傷已經基本恢復，故用作山楂核干餾液細胞活性實驗的陽性藥組質量濃度；山楂核干餾液在實驗范圍內（質量濃度不超過240μg·mL-1）時對LPS刺激RAW264.7細胞不產生損傷，L-NAME、Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D質量濃度分別不超過404.55、149.50、67.13、16.50、36.69μg·mL-1時對LPS刺激RAW264.7細胞不會造成損傷。同時山楂核干餾液、L-NAME 和4 個亞流分在各自質量濃度范圍內對LPS 刺激的RAW264.7細胞造成的損傷尚具有一定的恢復作用。

圖1 山楂核干餾液和4個亞流分對LPS刺激的RAW264.7細胞活性的影響（,n=3）

3.2 山楂核干餾液和4個亞流分體外抗炎活性

NO 測試結果（圖2）表明，L-NAME 對LPS 刺激的RAW264.7 細胞生成NO 量的半數抑制濃度（IC50）為（193.01±27.66）μg·mL-1，質量濃度為269.70μg·mL-1時NO產生量與模型組相比差異具有統計學意義，結合L-NAME 細胞活性測試結果，選擇269.70μg·mL-1作為山楂核干餾液抗炎活性實驗的陽性藥組質量濃度；山楂核干餾液顯著抑制了LPS刺激的RAW264.7 細胞生成NO 的量，其IC50為（31.93±1.95）μg·mL-1，表明山楂核干餾液有較好的抗炎活性。4 個亞流分（Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D）對LPS 刺激的RAW264.7 細胞生成NO 均有一定的抑制作用，且呈現劑量依賴性，LPS 刺激的RAW264.7 細胞生成NO的IC50分別為10.86±0.76）、（6.25±0.81）、（5.57±0.70）、（19.20±0.42）μg·mL-1；其中Fr.C 和Fr.B 的IC50均較低，兩者抑制LPS 刺激的RAW264.7 細胞生成NO 作用明顯強于山楂核干餾液和L-NAME，抗炎活性佳，結合細胞活性測試結果，Fr.C 約從33μg·mL-1開始產生細胞毒性，而Fr.B 約從67.13 μg·mL-1開始產生細胞毒性，綜合考慮Fr.B抗炎活性和安全性最佳。

圖2 山楂核干餾液和4個亞流分對LPS激活的RAW264.7細胞中NO產生的影響（,n=3）

3.3 山楂核干餾液和4個亞流分體外抗菌活性

體外抗菌實驗結果（圖3）表明，AMB 抑制白色念珠菌生長的MIC50為（2.65±0.52）μg·mL-1，在其質量濃度為4.69 μg·mL-1時，較2.34 μg·mL-1時的抑菌效果更佳，故作為山楂核干餾液抗菌活性實驗的陽性藥組質量濃度；山楂核干餾液對白色念珠菌的生長有抑制作用，其MIC50為（2.72±0.03）mg·mL-1，且在測試質量濃度范圍內，抑制作用呈現較好的劑量依賴性。Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D 對白色念珠菌均具有一定的抑制作用，且呈現劑量依賴性，MIC50分別為（2.98±0.54）、（0.91±0.03）、（3.42±0.13）、（2.40±0.08）mg·mL-1，4 個流分中Fr.B 的抗菌活性最為顯著，其抑制白色念珠菌的作用明顯強于山楂核干餾液。

3.4 山楂核干餾液亞流分的GC-MS分析結果

為了進一步研究并分析出山楂核干餾液中發揮體外抗炎和抗菌作用的主要有效成分。利用GC-MS測得山楂核干餾液4個亞流分的氣相色譜圖（圖4）。結果發現山楂核干餾液4 個亞流分有12 個共有峰。對抗炎抗菌活性較高的Fr.B 流分譜圖進行分析，主要呈現13 個色譜峰，其峰面積總和占到總峰面積的87.67%，具體質譜信息見表2。

表2 山楂核干餾液4個亞流分GC-MS圖譜峰的指認結果

圖4 山楂核干餾液4個亞流分的氣相色譜圖

3.5 山楂核干餾液抗炎灰色關聯度分析

采用灰色關聯度分析法研究山楂核干餾液中發揮體外抗炎和抗菌作用的主要有效成分。以3.4 項下12 個共有成分峰面積為獨立變量，以4 個亞流分抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞生成NO 的作用結果為因變量，進行灰色關聯度分析。所選的評價指標與藥效呈負相關，r越低，抑制LPS 刺激的RAW264.7 細胞生成NO 的IC50越小，表明該化合物具有較強抗炎活性。結果顯示（表3），12 個成分對抗炎作用貢獻大小順序為4＞6＞2＞9＞8＞3＞7＞5＞11＞12＞10＞1，其中，色譜峰4、6、2 和9 號對山楂核干餾液抗炎作用貢獻較大。

3.6 山楂核干餾液抗菌灰色關聯度分析

在本研究中所選的評價指標與藥效呈負相關，r越低，化合物對白色念珠菌的MIC50較小，表明該化合物具有較強抗菌活性。山楂核干餾液體外抑制白色念珠菌的灰色關聯度分析結果（表3）表明，12個成分對抗菌作用貢獻大小順序為4＞2＞9＞11＞7＞6＞5＞8＞10＞12＞3＞1，其中化合物4、2、9 和11 對山楂核干餾液抗菌作用貢獻較大。

表3 抗炎、抗菌活性關聯度分析

通過熱圖對4 個亞流分抗炎和抗菌灰色關聯結果進行可視化分析（圖5），結果表明，2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚、1，2，5-三甲氧基-3-甲基苯、2，6-二甲氧基苯酚和乙酰丁香酮可能是山楂核干餾液抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞生成NO 作用的關鍵活性成分；2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、乙酰丁香酮和二氫芥子醇可能是山楂核干餾液抑制白色念珠菌的關鍵活性成分。

圖5 山楂核干餾液4個亞流分12個共有峰峰面積與其抗炎IC50和抗菌MIC50活性的熱圖分析

4 討論

中藥譜效關系研究是將中藥化學成分譜圖與中藥藥效活性有機結合，采用相關性分析、灰色關聯度分析、主成分分析等多種數學分析模型，可多角度、更全面地進行中藥藥效物質基礎研究、中藥質量評價、中藥有效部位篩選等[11-14]。灰色關聯度分析方法強調因素間相關程度的順序，其“幾何對應”的特點也可使動態指標的原始信息得到充分的利用。該方法對樣本數量和數據規律性的要求較低，適用于評價中藥化學成分與藥效之間的關聯程度，篩選功效成分[15-16]。

迄今為止，山楂核干餾液抗炎和抗菌作用的物質基礎尚不清楚，本研究中以LPS 誘導的RAW264.7 細胞生成NO 模型評價4 個亞流分的抗炎作用，用微稀釋法評估其體外抑制白色念珠菌活性，采用GC-MS 對山楂核干餾液的4 個亞流分進行分析，得到了12 個共有化合物，其中4-乙基-2-甲氧基苯酚可抑制生物膜的形成，從而抑制細菌的生長[17]；4-甲氧基-3-羥基苯乙酮具有抗炎活性，可防止醋酸引起的結腸損傷[18]；丁香醛是一種酚類化合物，有抑制環氧合酶-2（COX-2）活性的作用，IC50為3.5 μg·mL-1[19]。糠醛還具有多種生物學活性[20]，如增加活性氧的形成，對細胞器、核酸和蛋白質造成損害，并干擾微生物的進化[21-22]。此外，其還可以抑制初級代謝中的酶，如乙醇脫氫酶，進而影響白色念珠菌的生長[23]。實驗又使用灰色關聯度分析法建立化學成分和抗炎抗菌作用的譜效關系，得出山楂核干餾液中各成分對抗菌抗炎作用貢獻的大小，并且篩選出山楂核干餾液中2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚、1，2，5-三甲氧基-3-甲基苯、2，6-二甲氧基苯酚和乙酰丁香酮4 個成分為其體外抗炎作用的關鍵活性成分；2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、乙酰丁香酮和二氫芥子醇為其抗菌作用的關鍵活性成分。其中2，6-二甲氧基苯酚在抑制白色念珠菌的生長中起重要作用，該結果與Rao 等[24]的研究一致。實驗結果表明，2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚抗炎作用和抗菌作用均較強，因此其可能是治療霉菌性陰道炎的主要活性化合物，但體內作用有待于進一步實驗驗證。

本研究結果為闡明山楂核干餾液抗炎和抗菌作用的物質基礎及山楂核干餾液質量控制和質量標準的制定提供了科學依據，同時為開發具有抗炎和抗菌作用的山楂核干餾液新產品提供了參考。