三臺麥冬塊根毒理學評價與抗營養因子分析△

蘇芳芳，錢丹，陳敏*，楊光*，高峰，李敏，楊以明

1.中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700；

2.河北中醫學院 藥學院，河北 石家莊 050200；

3.中國中醫科學院 西苑醫院，北京 100091；

4.成都中醫藥大學 藥學院，四川 成都 611137；

5.三臺縣麥冬產業化辦公室，四川 綿陽 621100

“藥食同源”是我國勞動人民在總結食物和藥物的食用特性后留下的智慧結晶，體現了食物在保健和治療方面的功能。隨著現代生活水平的不斷提高，人們的養生意識日益加強，對飲食健康的要求也逐漸提高。為了保障食品供給的安全和來源的可持續性，早在2007 年原衛生部就頒布了《新資源食品管理辦法》[1]，后經多次修訂和完善，最終于2018 年通過修正后的《新食品原料安全性審查管理辦法》[2]。隨著國家對食品安全問題的不斷重視，作為食品來源的物品均要經過食用歷史考證、生產工藝核查、安全性評價、全成分檢測、食用風險評估等一系列環節的科學評估才能獲得相關管理部門的認可。

麥冬又名麥門冬，為我國大宗常用中藥之一，《神農本草經》列之為上品。2002 年原衛生部將麥冬列入《可用于保健食品的物品名單》中，其保健功效得到認可。近年來，中華人民共和國國家衛生健康委員會多次發布藥食同源和新食品原料的征求意見稿，越來越多的中藥經過食用歷史考證和安全性評價等審核后被開發應用為食品，如人參、當歸等常用大宗中藥材已先后列入新資源食品和藥食同源物品名錄中。四川省衛生健康委員會在2019 年針對麥冬須根出臺了《食品安全地方標準 麥冬須根》（DBS 51/007—2019）[3]，這為麥冬在食品領域的發展提供了參考標準。從食用歷史來看，早在唐代就出現有關麥冬食用的記載，在民間，麥冬也已成為廣東、四川等地區的傳統食品，四川居民常將麥冬加入牛奶、火鍋等日常食物中共同熬煮[4]，因此將麥冬作為食品來源也符合社會發展需求。

本研究針對道地藥材三臺麥冬進行毒理學實驗和抗營養因子成分分析，為三臺麥冬的食用安全性提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物與菌株

SD 大鼠（雌鼠110 只、雄鼠60 只），SPF 級，體質量180～200 g；離乳SD 大鼠（雌鼠50 只、雄鼠50 只），SPF 級，體質量60～90 g；昆明種小鼠（雌鼠25 只、雄鼠75 只），SPF 級，體質量18～22 g；實驗動物均由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（陜）2012-0003；動物飼養于SPF 級實驗動物房，室溫20～25 ℃，濕度45%～65%，在新環境適應飼養3 d，給藥前禁食8～12 h，不限制飲水。

鼠傷寒沙門氏菌突變型TA97、TA98、TA100、TA102均由國家（成都）中藥安全性評價中心提供。

1.2 試藥

麥冬采自四川省綿陽市三臺縣10 個不同地區，樣品采集時間為2017 年3 月21 日—4 月30 日，經成都中醫藥大學李敏教授鑒定為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus（L.f.）Ker-Gawl.的塊根，采用球磨儀進行打粉處理，備用，用蒸餾水做溶劑配制樣品。毒理學實驗中所用麥冬粉末為10 批樣品的混合品，樣品產地信息見表1。

表1 麥冬樣品取樣地信息

環磷酰胺（CP）、2-氨基芴、1，8-二羥基蒽醌（Sigma-Aldrich 公司）；敵克松（Chemservice 公司）；疊氮化鈉（中國北京鼎國生物技術有限責任公司）；大鼠肝微粒體酶（美國Moltox公司）。

1.3 儀器

BS-420 型全自動生化分析儀、BC-2800Vet 型血細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；Uritest-200B 型尿液分析儀（桂林優利特醫療電子有限公司）。

2 方法

2.1 安全性及毒理學實驗

2.1.1 大鼠急性毒性實驗 取SD 大鼠20 只，雌雄各半。按限量法設定灌胃給藥劑量為17.0 g·kg-1（相當于人體推薦量的340 倍），給予0.425 mg·mL-1樣品溶液2次，灌胃體積為20 mL·kg-1。灌胃后連續觀察14 d內大鼠的中毒癥狀及死亡情況，記錄實驗開始、第7天及第14天大鼠體質量[5]。

2.1.2 遺傳毒性實驗

2.1.2.1 細菌回復突變實驗 采用平板摻入法[5]。選用經鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌突變型TA97、TA98、TA100、TA102 4 種菌株，以多氯聯苯誘導的大鼠肝微粒體酶（S9）作為體外代謝活化系統，將菌株接種于營養肉湯瓊脂培養基內。加入麥冬塊根溶液0.1 mL，使麥冬塊根終劑量分別為5000.0、1000.0、200.0、40.0、8.0 μg/皿。并設溶劑（蒸餾水）對照組、自發回變組和陽性對照組。自發回變組不做處理。每組做3 個平行皿。-S9 陽性對照藥物：TA97 采用敵克松50.0 μg/皿；TA98采用敵克松50.0 μg/皿；TA100采用疊氮化鈉1.5 μg/皿；TA102 采用敵克松50.0 μg/皿。+S9 陽性對照藥物：TA102采用1，8-二羥基蒽醌50.0 μg/皿，其余3 個菌株均采用2-氨基芴10.0 μg/皿。每皿加入陽性對照的體積為0.1 mL。37 ℃培養48 h，計數每皿回變菌落數。

2.1.2.2 哺乳動物紅細胞微核實驗 采用30 h 2 次灌胃給藥法進行實驗。選用昆明種小鼠50 只，雌雄各半，隨機分為5 組，設對照組（蒸餾水）、CP（40 mg·kg-1）陽性對照組及麥冬塊根10.0、5.0、2.5 g·kg-1組，給藥量為20 mL·kg-1。末次給藥6 h后，頸椎脫臼處死小鼠，取股骨骨髓于小牛血清中涂片、固定、染色，觀察計數[5]。

2.1.2.3 小鼠精原細胞畸變實驗 選用雄性昆明種小鼠50 只，隨機分為5 組，每組10 只。分組及給藥劑量同2.1.2.2 項下，連續灌胃5 d。在處死前5 h按5 mg·kg-1劑量給小鼠腹腔注射秋水仙素溶液，脫頸椎處死小鼠，取雙側附睪制片，染色、觀察。每只動物計數100 個中期分裂相細胞，記錄染色體畸變類型、數量和畸變細胞率[5]。

2.1.3 大鼠致畸實驗 取SD 大鼠雌性100 只、雄性50 只，按雌性-雄性2∶1 同籠，次晨查陰栓確定受精鼠并隨機分到各組。將受精鼠稱體質量、編號、記錄受精日期，作為受孕0 d。設置麥冬塊根5.00、2.50、1.25 g·kg-1組和溶劑（蒸餾水）對照組。課題組曾用CP 做陽性藥開展過致畸實驗，在SD 大鼠中有陽性結果發現，所以本實驗略去陽性對照組。在大鼠受孕的第6～15 d，按10 mL·kg-1的灌胃量每日1 次進行灌胃，溶劑對照組灌胃等體積蒸餾水，并記錄大鼠在孕期第0、6、9、12、15、20 天體質量，觀察記錄動物的一般行為、表現及有無中毒體征；在孕第20 天處死母體，剖腹取出子宮，檢查黃體數、胚胎著床數、吸收胎數、活胎數及死胎數。逐一記錄胎鼠性別、體質量、身長，檢查有無外觀畸形。分別將每窩各1/2左右的胎鼠作內臟及骨骼檢查[5]。

2.1.4 90 d 喂養實驗 選用離乳SD 大鼠100 只，雌雄各半，隨機分成5 組，設溶劑（蒸餾水）對照組和麥冬塊根5.00、2.50、1.25 g·kg-1（分別相當于人體推薦量的100、50、25倍）組。另設5.00 g·kg-1作為高劑量組和溶劑（蒸餾水）對照組做衛星組，每組10 只大鼠，雌雄各半，用于中期血液指標測定。按10 mL·kg-1每日經口灌胃1 次，連續90 d，每周稱1次體質量和2次飼料量，記錄給食量和剩食量，計算每周及總增質量、進食量和食物利用率。實驗中期和結束后采血進行血液學檢查，動物進行大體解剖，觀察臟器變化[5]。

2.2 抗營養因子實驗

2.2.1 胰蛋白酶抑制劑的測定 參考付煊赫等[6]的方法，采用分級鹽析的方式進行胰蛋白酶抑制劑提取。稱取麥冬樣品1.00 g于10 mL去離子水中，室溫磁力攪拌2 h（400 r·min-1），離心（4 ℃，4000 r·min-1，30 min，離心半徑為13.5 cm）。沉淀用去離子水5 mL重復以上操作，合并2次上清液。上清液用65 ℃水浴加熱10 min，迅速冷卻后離心（4 ℃，4000 r·min-1，30 min，離心半徑為13.5 cm），上清液加固體硫酸銨至飽和度為35%，4 ℃靜置過夜，離心（4 ℃，4000 r·min-1，30 min，離心半徑為13.5 cm）；繼續取上清，加固體硫酸銨至飽和度為55%，4 ℃靜置8 h，離心（4 ℃，4000 r·min-1，30 min，離心半徑為13.5 cm），取沉淀，用去離子水800 μL 溶解，在去離子水中充分透析24 h，離心（4 ℃，10 000 r·min-1，10 min，離心半徑為13.5 cm），上清液即為胰蛋白酶抑制劑粗提物。胰蛋白酶活性測定方法參照《中華人民共和國藥典》2020 年版（二部）N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）法測定。

2.2.2 凝集素的測定 稱取麥冬塊根粉末1 g，加0.9%氯化鈉溶液8 mL提取10 h，離心（4 ℃，5000 r·min-1，20 min，離心半徑為13.5 cm）；取上清液，加入硫酸銨達到飽和度為50%，4 ℃過夜；離心（4 ℃，5000 r·min-1，30 min，離心半徑為13.5 cm）后收集沉淀，用pH 7.40 的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，離心（4 ℃，4000 r·min-1，10 min，離心半徑為13.5 cm），上清液在PBS 中透析過夜，之后繼續在蒸餾水中透析2～4 h，置于聚乙二醇中吸水濃縮，得到粗凝集素。用二喹啉甲酸（BCA）法測定麥冬塊根的凝集素含量[7]。

2.2.3 植酸的測定 稱取麥冬粉末1 g 于50 mL 離心 管。加0.01 mol·L-1HCl 20 mL，離心（4 ℃，6000 r·min-1，10 min，離心半徑為13.5 cm），上清液用20 mL 量瓶定容。稱取FeCl3·6H2O 磺基水楊酸30 mg定容至100 mL，做反應液。以不同質量濃度植酸鈉做對照品，按樣品-反應液-水5∶5∶4 混勻，離心（4 ℃，3000 r·min-1，10 min，離心半徑為13.5 cm），室溫靜置20 min，于500 nm處測吸光度[8]。

2.2.4 非淀粉多糖的測定 稱取麥冬樣品0.5 g 于15 mL 離心管中，加80%乙醇5 mL，水浴90 ℃加熱30 min；離心（4 ℃，6000 r·min-1，2 min，離心半徑為13.5 cm）。上清液用氮氣吹干。加pH 為5的醋酸緩沖液5 mL，金屬浴100 ℃加熱30 min，取出即加入15 U·mL-1的α-淀粉酶375 μL，加醋酸緩沖液，補足樣品液至10 mL，混勻，離心（4 ℃，9000 r·min-1，2 min，離心半徑為13.5 cm）。上清液備用。以無水葡萄糖為對照品，按照樣品-苯酚-濃硫酸4∶2∶10室溫放置25 min進行反應，在490 nm處測吸光度。根據標準曲線計算供試品溶液中葡萄糖含量[9]。

2.2.5 多酚類化合物的測定

2.2.5.1 槲皮素的測定 稱量麥冬粉末1.00 g，加80%乙醇8 mL浸泡24 h。超聲提取1 h，離心（4 ℃，3500 r·min-1，15 min，離心半徑為13.5 cm），上清液烘干得到塊狀固體。精密稱取塊狀固體0.05 g，加60%乙醇溶解定容至50 mL，作為供試品溶液。采用紫外分光光度法，以60%乙醇作為空白對照，以不同質量濃度的槲皮素為對照品，在371 nm 測定樣品吸光度[10]。

2.2.5.2 沒食子酸的測定 精密稱取麥冬粉末0.2 g，加50%乙醇4 mL，浸提24 h，超聲提取30 min，離心（4 ℃，3500 r·min-1，10 min，離心半徑為13.5 cm），取上清液2 mL，定容至25 mL量瓶中。取上述定容液體0.1 mL，加福林酚試劑50 μL，反應3 min，再加6%碳酸鈉溶液3 mL，加蒸餾水稀釋至5 mL，混勻，避光保存2 h。采用紫外-可見分光光度法，以相應試劑作為空白對照，以不同質量濃度的沒食子酸為對照品，760 nm測樣品吸光度[11]。

2.2.5.3 阿魏酸的測定 稱量麥冬粉末0.2 g 置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，浸提24 h，超聲1 h，離心取上清液，采用紫外-可見分光光度法，以相應試劑作為空白對照，以不同質量濃度的阿魏酸為對照品，在316 nm處測樣品吸光度[12]。

2.3 數據統計

哺乳動物紅細胞微核實驗采用u檢驗。小鼠精原細胞畸變實驗采用二項分布統計處理。90 d 喂養實驗數據進行單因素方差分析。在統計分析時，先對數據進行方差齊性檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析進行總體比較，發現差異再用Dunnett檢驗進行多劑量組與對照組均數間的兩兩比較。若方差不齊則對數據進行適當的變量轉換，滿足方差齊性檢驗后，用轉換后的數據進行統計；若轉換后的數據仍未達到方差齊要求，改用秩和檢驗進行統計分析。上述統計均用SPSS 20.0軟件處理。

3 結果與分析

3.1 安全性及毒理學評價

3.1.1 急性毒性實驗 結果顯示，按限量法以17.0 g·kg-1劑量給藥后，大鼠生長良好，未見體質量受到影響。雌性大鼠初始、給藥第7 天、給藥第14 天體質量分別為（193.0±7.3）、（230.0±13.1）、（259.6±14.1）g，雄性大鼠初始、給藥第7天、給藥第14 天體質量分別為（199.3±10.5）、（199.3±10.5）、（199.3±10.5）g。雌、雄大鼠均未見有明顯中毒癥狀，無死亡。實驗結束解剖大鼠，大體觀察未見明顯異常。結果表明，三臺麥冬對雌、雄大鼠急性經口毒性半數致死量（LD50）均大于17.0 g·kg-1。根據急性毒性分級標準，三臺麥冬屬于無毒級。

3.1.2 遺傳毒性實驗

3.1.2.1 細菌回復突變實驗 由表2～5 可見，在加或不加S9 的情況下，樣品各劑量組的回變菌落數均未超過自發回變菌落的2 倍，亦無劑量-反應關系，表明該樣品細菌回復突變實驗結果為陰性。

表2 三臺麥冬塊根TA97細菌回復突變實驗結果（,n=3）

表2 三臺麥冬塊根TA97細菌回復突變實驗結果（,n=3）

注：-S9組陽性藥為敵克松；+S9組陽性藥為2-氨基芴；表3同。

3.1.2.2 哺乳動物紅細胞微核實驗 由表6 可見，麥冬各劑量組小鼠的紅細胞微核率與溶劑對照組比較，差異均無統計學意義，而CP陽性對照組的微核率與溶劑對照組差異有統計學意義（P＜0.01），各劑量組的未成熟紅細胞（PCE）與成熟紅細胞（NCE）的比值在正常范圍內，哺乳動物紅細胞微核實驗結果為陰性。

3.1.2.3 小鼠精原細胞畸變實驗 由表7 可見，與溶劑對照組比較，麥冬3 個劑量組畸變細胞率差異無統計學意義，而CP陽性對照組畸變細胞率則顯著升高（P＜0.01）。染色體畸變類型主要表現以斷裂、斷片為主。結果表明，小鼠精原細胞畸變實驗結果為陰性。

表3 三臺麥冬塊根TA98細菌回復突變實驗結果（,n=3）

表3 三臺麥冬塊根TA98細菌回復突變實驗結果（,n=3）

表4 三臺麥冬塊根TA100細菌回復突變實驗結果（,n=3）

表4 三臺麥冬塊根TA100細菌回復突變實驗結果（,n=3）

注：-S9組陽性藥為疊氮化鈉；+S9組陽性藥為2-氨基芴。

表5 三臺麥冬塊根TA102細菌回復突變實驗結果（,n=3）

表5 三臺麥冬塊根TA102細菌回復突變實驗結果（,n=3）

注：-S9組陽性藥為敵克松；+S9組陽性藥為1，8-二羥基蒽醌。

表6 三臺麥冬塊根的哺乳動物紅細胞微核實驗結果（,n=5）

表6 三臺麥冬塊根的哺乳動物紅細胞微核實驗結果（,n=5）

注：每組檢查PCE數均為5000個；與對照組比較，**P＜0.01。

表7 三臺麥冬塊根對小鼠精原細胞畸變實驗結果（,n=10）

表7 三臺麥冬塊根對小鼠精原細胞畸變實驗結果（,n=10）

3.1.3 90 d 喂養實驗 90 d 喂養實驗結果表明，與溶劑對照組比較，三臺麥冬各劑量組對大鼠體質量增長、進食量、食物利用率差異無統計學意義；血液學指標、血液生化學指標、臟器濕質量、臟器質量/體質量差異均無統計學意義（表8～10）。實驗前對所有大鼠進行眼部檢查，實驗后對高劑量組和溶劑對照組大鼠進行眼部檢查，均未見明顯異常改變；大體解剖觀察和組織病理學檢查未見與樣品有關的異常改變。在受試劑量范圍內均未見該樣品對大鼠各項觀察指標產生影響。

表8 三臺麥冬塊根對大鼠血液學指標的影響（,n=10）

表8 三臺麥冬塊根對大鼠血液學指標的影響（,n=10）

3.1.4 致畸實驗 結果表明，與溶劑對照組比較，三臺麥冬各劑量孕鼠體質量及增質量差異均無統計學意義（表11）；胎仔外觀、活胎總數、胎鼠體質量、體長、骨骼、內臟檢查差異均無統計學意義。各劑量組孕鼠均未見明顯致畸作用。

注：受檢細胞數均為1000個；與對照組比較，**P＜0.01。

表9 三臺麥冬塊根對大鼠血液生化學指標的影響（,n=10）

表9 三臺麥冬塊根對大鼠血液生化學指標的影響（,n=10）

表10 三臺麥冬塊根對大鼠臟器質量與體質量比值的影響（,n=10）

表10 三臺麥冬塊根對大鼠臟器質量與體質量比值的影響（,n=10）

表11 三臺麥冬塊根對孕鼠體質量的影響（,n=16）

表11 三臺麥冬塊根對孕鼠體質量的影響（,n=16）

3.2 抗營養因子實驗

3.2.1 胰蛋白酶抑制劑、凝集素、植酸、非淀粉多糖 三臺麥冬塊根中胰蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶的平均抑制率為35.19%（表12）。因文獻針對常見食品的胰蛋白抑制劑的描述較少，故缺少對比說明。凝集素的平均質量分數為2.737 mg·g-1，據文獻報道，大豆中凝集素的質量分數最高為37.5 mg·g-1，最低為1.88 mg·g-1，大部分集中在4.22～13.13 mg·g-1[13]，由此可見，三臺麥冬中凝集素質量分數低于大豆。植酸的平均質量分數為0.120 8 mg·g-1，文獻報道中顯示，植酸在豆制品中如腐竹、青豆、黃豆等食物中質量分數分別為20.78、14.27、13.74 mg·g-1[14]，均高于三臺麥冬的植酸含量。三臺麥冬中非淀粉多糖質量分數均值為0.115 g·g-1。文獻顯示，在幾種常用中藥的非淀粉多糖含量研究中，蘆薈的非淀粉多糖質量分數為41.55 g·kg-1，黃芪中為610.6 g·kg-1[15]，遠高于在三臺麥冬中的含量。

表12 三臺麥冬塊根的胰蛋白酶抑制劑的測定結果（n=3）

3.2.2 多酚類化合物 三臺麥冬塊根中槲皮素平均質量分數為0.044 g·g-1，沒食子酸平均質量分數為5.098 mg·g-1，阿魏酸的平均質量分數為4.875 mg·g-1（表13）。

表13 三臺麥冬塊根中多酚類化合物質量分數（n=3）

4 討論

麥冬雖然在我國使用歷史悠久，但關于其毒理學評價的研究較少。本研究從多維度評價了三臺麥冬的毒性，在急性經口毒性實驗、遺傳毒性實驗、大鼠致畸實驗和90 d 經口毒性實驗中均未觀察到三臺麥冬對大鼠及小鼠的各項指標產生不良影響。盡管在體外條件下麥冬水煎液可能會引起細胞位點突變，但經體內代謝活化后并未顯示遺傳毒性[16]。有學者在觀察麥冬水浸提液對大鼠胚胎/胎兒的發育毒性中發現，在相當于人臨床最大用量的135 倍條件下，其仍表現出極好的安全性[17]。在對麥冬須根的安全性評價中，也未發現其對實驗鼠健康造成影響[18]。這些都表明麥冬在臨床劑量范圍內服用是安全的。

麥冬塊根中的抗營養因子為植物中常見的幾類物質，主要包括胰蛋白酶抑制劑、凝集素、植酸、非淀粉多糖、多酚化合物等。豆類、花生及谷實類、塊根、塊莖等食品中都含有微量的抗營養因子，在加工、加熱等工藝過程中可以消除和破壞大部分的抗營養因子。本研究表明，三臺麥冬的抗營養因子在推薦劑量下無健康風險。

我國已步入老齡化社會，市場上面臨著巨大的養生保健需求。“藥食同源”和飲食療法是中華民族最古老的治病強身方法，中醫藥具有許多可作為食品食用的中藥材。現代研究表明，麥冬具有降血糖、保護心血管系統、增強免疫等活性，具有潛在的食用開發價值[19]。但是，限于《中華人民共和國食品安全法》等政策規定，麥冬尚不能作為普通食品使用，這嚴重地制約了麥冬產業的進一步發展。將麥冬推薦為食用來源，有助于滿足我國在養生保健和養老方面的訴求，豐富中醫藥大健康產業的內涵。