核磁共振技術在首批中藥化學對照品研制中的應用△

劉靜，馮玉飛，劉陽，戴忠，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術是一種非常重要的有機化合物結構解析工具[1-3]。通過解析一維譜（如1H-、13C-NMR）化學位移值、譜峰多重性、偶合常數值、譜峰相對強度和各種二維譜[如異核單量子相關譜（HSQC）、異核多鍵相關譜（HMBC）、1H-1H COSY]中呈現的相關峰，能夠獲取定性結構信息。對于結構復雜或結構未知的化合物，通常需要結合其他譜學方法確定其結構。對于結構簡單或已知化合物，可直接通過一維譜信號或與文獻值比對進行確定。NMR 還可以用于定量分析，以氫核磁共振定量（1H-quantitative nuclear magnetic resonance，1H-qNMR）應用最多，其原理是在合適實驗條件下，信號峰面積與產生信號的質子數成正比[4-6]。1H-qNMR 具有樣品用量少、測定時間短及無損等優勢，目前已廣泛應用于藥品質量控制等領域，并已收載于《中華人民共和國藥典》2020 年版[7]、《美國藥典》USP40-NF35[8]和《歐洲藥典》10.0版[9]等。

中藥化學對照品主要從天然產物中提取精制而得，通常為結構已知成分，但由于天然產物結構復雜多樣，常存在異構體，因此，首批對照品的定性鑒別工作仍需高度重視，準確鑒定其結構是對照品準確性的源頭保障。在實際工作中，通常采用NMR、質譜、紫外、紅外等譜學技術，但NMR 提供的結構信息更為豐富。中藥化學對照品的定值目前采用國際通用的質量平衡法，對于首批品種而言，還需要其他定值方法進行佐證，尤以1H-qNMR 應用廣泛。本文結合中藥化學對照品首批研制實例，闡述了NMR的定性和定量特性，為充分保障首批對照品結構與定值的準確性提供了科學依據。

1 定性鑒定

1.1 結構相近化合物

槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷（1）和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷（2）均屬于黃酮苷類化合物，結構相近，兩者結構差異在于黃酮苷元B 環（圖1）。1H-NMR分析表明，前者B 環為C-3′，4′-二羥基取代，其B環質子H-5′作為1 個二重峰（d,J=8.0 Hz）出現在δ6.70～7.10 處，H-2′（d,J=2.0 Hz）和H-6′（dd,J=8.0,2.0 Hz）信號出現在δ7.20～7.50 處，且通過H-2′和H-6′化學位移可區別黃酮C-3′,4′位上是羥基還是甲氧基；后者B 環為C-4′位羥基取代，其B 環質子分為H-2′,6′和H-3′,5′，構成AA′BB′系統，且H-3′,5′化學位移比H-2′,6′化學位移值小，主要是C-4′位羥基的屏蔽作用及C 環對H-2′,6′的負屏蔽效應。通過13C-NMR 分析，C-2～4 位化學位移表明兩者均屬于黃酮-3-氧苷類化合物，進一步分析表明其A環為C-5，7-二羥基黃酮類化合物，其C-6和C-8 化學位移信號為δ90.0～100.0，且C-6 信號較C-8 信號處于較低場。此外，對于兩者取代糖基的確定，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-α-L-鼠李糖苷質譜中出現m/z303 [M+H-162-146]+基峰碎片，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷質譜中出現m/z287[M+H-162-146]+基峰碎片，表明兩者結構中均存在1 個六碳醛糖和甲基五碳醛糖；結合1H-NMR，通過2個糖端基質子信號偶合常數可判斷分別為β-D型（J=7.5 Hz）和α-L型（J=1.0 Hz）；進一步綜合1H-NMR、13C-NMR 信號確定為β-D-葡萄糖基和α-L-鼠李糖基。通過與文獻比對，歸屬兩者核磁信號[10]。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷：1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.30(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.26(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6′),6.87 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.32(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.15 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6),5.59 (1H,d,J=1.0 Hz,H-1″),4.31 (1H,d,J=7.5 Hz,H-1?),4.21 (1H,dd,J=3.5,1.5 Hz,H-2″),3.80 (1H,dd,J=11.0,3.5 Hz,H-3″),3.61 (1H,dd,J=12.0,4.5 Hz,H-6?),3.57 (1H,dd,J=12.5,2.5 Hz,H-6?),0.92 (3H,d,J=6.0 Hz,H-6″)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ:159.3 (C-2),136.5 (C-3),179.6 (C-4),163.2 (C-5),99.9 (C-6),166.0 (C-7),94.7 (C-8),158.5 (C-9),105.9 (C-10),122.8 (C-1′),116.9 (C-2′),146.5 (C-3′),149.9 (C-4′),116.4 (C-5′),122.8(C-6′)；鼠李糖基:102.6 (C-1″),82.9 (C-2″),71.7(C-3″),73.5 (C-4″),72.0 (C-5″),17.7 (C-6″)；葡萄糖基：107.2 (C-1?),75.3 (C-2?),77.8 (C-3?),70.7(C-4?),77.8(C-5?),62.1(C-6?)。山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷：1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.72 (2H,dd,J=7.0,2.0 Hz,H-2′,6′),6.89(2H,dd,J=7.0,2.0 Hz,H-3′,5′),6.32(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.15 (1H,d,J=2.5 Hz,H-6),5.67 (1H,d,J=1.0 Hz,H-1″),4.36 (1H,d,J=7.5 Hz,H-1?),4.23(1H,dd,J=3.5,1.5 Hz,H-2″),3.74 (1H,dd,J=10.0,3.5 Hz,H-3″),3.66 (1H,dd,J=12.0,2.5 Hz,H-6?),3.61 (1H,dd,J=12.0,4.5 Hz,H-6?),0.88(3H,d,J=7.5 Hz,H-6″)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ:159.4 (C-2),136.4 (C-3),179.5 (C-4),163.2 (C-5),100.0 (C-6),166.1 (C-7),94.8 (C-8),158.6 (C-9),105.9 (C-10),122.5 (C-1′),132.0 (C-2′),116.6 (C-3′),161.7 (C-4′),116.6 (C-5′),132.0(C-6′)；鼠李糖基：102.5 (C-1″),82.7 (C-2″),71.7(C-3″),73.4 (C-4″),72.0 (C-5″),17.6 (C-6″)；葡萄糖基：107.1 (C-1?),75.3 (C-2?),77.8 (C-3?),70.9(C-4?),77.9(C-5?),62.3(C-6?)。

圖1 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷（1）和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷（2）的化學結構式

1.2 同分異構體

地黃苷D（3）為環烯醚萜苷類成分，與文獻報道的苦郎樹苷C（sammangaoside C，4）[11]為同分異構體（圖2），兩者主要結構差異在于C-5位糖基連接位置不同。結合文獻報道[11-13]，通過1H-NMR、13C-NMR 數據分析初步推斷為地黃苷D；進一步通過HSQC、HMBC 等二維譜圖分析，特別是HMBC 譜中葡萄糖端基質子δ4.92 (H-1″)與苷元C-5 位信號δ84.0 相關，葡萄糖端基質子信號δ4.82 (H-1?)與碳信號δ82.8(C-2″)相關，以及葡萄糖基質子信號δ3.64(H-2″)與葡萄糖端基碳信號δ105.8(C-1?)相關，由此確定環烯醚萜苷元C-5 位2 個葡萄糖基為1→2連接，即證明本品為地黃苷D，而非苦郎樹苷C，同時明確地黃苷D信號歸屬：1H-NMR(600 MHz,D2O)δ:5.41

圖2 地黃苷D（3）和苦郎樹苷C（4）的化學結構式

(1H,d,J=5.4 Hz,H-1),6.55 (1H,d,J=6.6 Hz,H-3),5.28 (1H,d,J=6.6 Hz,H-4),4.52 (1H,s,H-6),5.87(1H,dd,J=1.8,1.2 Hz,H-7),3.31(1H,m,H-9),4.30(1H,d,J=15.6 Hz,H-10),4.24 (1H,d,J=15.6 Hz,H-10),4.78 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1′),4.92 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1″),4.82(1H,d,J=7.8 Hz,H-1?)；13C-NMR(150 MHz,D2O)δ:98.6 (C-1),146.6 (C-3),107.0 (C-4),84.0 (C-5),83.0 (C-6),130.5 (C-7),147.4 (C-8),54.1 (C-9),62.5 (C-10),101.0 (C-1′),75.7 (C-2′),78.3 (C-3′),72.3 (C-4′),79.0 (C-5′),63.4 (C-6′),99.2 (C-1″),82.8 (C-2″),78.4 (C-3″),72.2 (C-4″),78.8 (C-5″),63.3 (C-6″),105.8 (C-1?),76.8 (C-2?),78.5(C-3?),72.5(C-4?),79.2(C-5?),63.7(C-6?)。

1.3 立體異構體

甲基蓮心堿（5）為雙芐基異喹啉類生物堿成分，與蝙蝠葛堿（6）為立體異構體（圖3），兩者主要結構差異在于C-1′位立體構型不同。在結構鑒定過程中，通過解析1H-NMR、13C-NMR譜圖，并與文獻比對[14]，初步鑒定為甲基蓮心堿。對于其結構中2 個手性中心立體結構的確定方法，經文獻調研可知，甲基蓮心堿及其立體異構體蝙蝠葛堿中C-1和C-1′位的立體構型，可根據C-9、C-9′及C-4、C-4′的化學位移差值來確定[15-16]。通過本品核磁碳譜數據解析結果可知，C-9、C-9′及C-4、C-4′的化學位移差值分別為Δδ0.8、Δδ0.9，符合文獻報道Δδ(C-9/C-9′)0.7，Δδ(C-4/C-4′)0.9，因此確定本品C-1 和C-1′位立體構型分別為R、S型，即為甲基蓮心堿，信號歸屬為：1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ:3.59 (1H,dd,J=6.6,6.0 Hz,H-1),2.73,3.13 (各1H,m,H-3),2.53,2.82 (各1H,m,H-4),6.50 (1H,s,H-5),6.62 (1H,s,H-8),2.67(1H,m,H-9),3.04(1H,dd,J=5.4,13.8 Hz,H-9),6.90 (2H,d,J=8.4 Hz,H-11,15),6.69 (2H,d,J=8.4 Hz,H-12,14),2.49 (3H,s,C2-NCH3),3.72(3H,s,C6-OCH3),3.54 (3H,s,C13-OCH3),3.63 (1H,dd,J=6.0,6.0 Hz,H-1′),2.73,3.13 (各1H,m,H-3′),2.60,2.82 (各1H,m,H-4′),6.01 (1H,s,H-5′),6.38 (1H,s,H-8′),2.78 (1H,m,H-9′),2.99 (1H,dd,J=5.4,13.8 Hz,H-9′),6.55 (1H,d,J=1.8 Hz,H-11′),6.84 (1H,d,J=8.4 Hz,H-14′),6.69 (1H,重疊,H-15′),2.45 (3H,s,C2′-NCH3),3.79 (3H,s,C6′-OCH3),3.80 (3H,s,C7′-OCH3)；13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ:64.4 (C-1),46.7 (C-3),25.2 (C-4),129.2(C-4a),111.1 (C-5),147.1 (C-6),148.9 (C-7),112.3(C-8),131.1 (C-8a),40.6 (C-9),131.9 (C-10),130.4(C-11),113.4 (C-12),144.7 (C-13),113.4 (C-14),130.4 (C-15),42.7 (C2-NCH3),55.4 (C6-OCH3),55.1(C13-OCH3),64.7 (C-1′),47.2 (C-3′),26.1 (C-4′),125.7 (C-4a′),110.9 (C-5′),145.4 (C-6′),146.3 (C-7′),119.2 (C-8′),130.5 (C-8a′),39.8 (C-9′),131.4(C-10′),120.0(C-11′),142.8(C-12′),157.7(C-13′),115.4 (C-14′),125.2 (C-15′),42.5 (C2′-NCH3′),55.8(C6′-OCH3′),55.7(C7′-OCH3′)。

圖3 甲基蓮心堿（5）和蝙蝠葛堿（6）的化學結構式

25S-魯斯可皂苷元（7）及其立體異構體25R-魯斯可皂苷元（8）均屬螺甾烷衍生物，分屬螺甾烷醇和異螺甾烷醇類成分，其差別在于兩者C-25位構型不同，分別為S構型和R構型（圖4）。文獻報道兩者可通過13C-NMR譜中C-23～27位化學位移值可加以區分，其中25S-魯斯可皂苷元相應化學位移值分別為δ26.5(C-23)、26.3 (C-24)、27.6 (C-25)、65.2 (C-26)、16.4(C-27)；25R-魯斯可皂苷元相應化學位移值分別為δ32.1(C-23)、29.5(C-24)、30.7(C-25)、67.1(C-26)、17.4(C-27)[17-18]，在實際工作中，可參照此規律用于確定魯斯可皂苷元C-25位立體構型。

圖4 25S-魯斯可皂苷元（7）和25R-魯斯可皂苷元（8）化學結構式

2 定量分析

1H-qNMR 應用于首批中藥化學對照品輔助定值時常采用內標法，按照公式（1）計算化合物含量。

其中，A樣為樣品選定信號的積分面積；A內為內標選定信號的積分面積；n樣為樣品被積分信號包含的質子數；n內為內標被積分信號包含的質子數；W樣為樣品稱樣量；W內為內標稱樣量；M樣為樣品相對分子質量；M內為內標相對分子質量[19]。

2.1 含殘留溶劑對照品

1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯質量平衡法定值結果為95.61%。為更好地佐證定值結果的準確性，平行制備3 份樣品進行1H-qNMR分析，以馬來酸作為內標，氘代甲醇為溶劑，以樣品中δ7.07 處氫信號為定量峰，δ6.32 氫信號為內標峰（圖5），根據公式（1）計算結果為97.32%，RSD 為0.41%，與質量平衡法結果基本一致。需要特別指出的是，本品IH-NMR、I3C-NMR 譜圖定性分析結果表明存在乙酸乙酯的相關信號，后經氣相色譜法（GC）驗證，外標法確定本品殘留溶劑為乙酸乙酯，外標法計算其質量分數為1.73%，RSD 為1.28%；在1H-qNMR 分析時，以乙酸乙酯δ4.10 氫信號作為定量峰，計算其質量分數為1.67%，RSD為3.41%，與GC 測定結果基本一致。由此可見，1H-qNMR 可同時一步測定供試品及其所含殘留溶劑含量，結果可靠，操作簡便快速。

圖5 1，4-二[4（-葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯的1H-qNMR譜圖

2.2 其他對照品

地黃苷D 質量平衡法定值結果為95.55%。在進行1H-qNMR 分析時，以鄰苯二甲酸氫鉀作為內標，氘代水為溶劑，以樣品中δ5.87 處氫信號為定量峰，鄰苯二甲酸氫鉀δ7.73 氫信號為內標峰，根據公式（1）計算結果為94.21%，RSD 為0.80%，與質量平衡法結果基本一致。

甲基蓮心堿質量平衡法定值結果為99.09%。在進行1H-qNMR 分析時，以對苯二甲酸二甲酯作為內標，氘代三氯甲烷為溶劑，以樣品中δ6.39 處氫信號為定量峰。對苯二甲酸二甲酯δ8.10 氫信號為內標峰，根據公式（1）計算結果為99.53%，RSD 為0.58%，與質量平衡法結果基本一致。

需要說明的是，盡管氫核磁共振定量法較質量平衡法操作簡便，但測定結果的準確性也受一些因素影響，包括溶劑選擇、內標物選擇、溶解度及儀器相關參數設置等，在實際操作過程中應結合具體品種加以摸索優化[19]。

3 結論

中藥化學對照品的重要性不言而喻，準確鑒定結構及確定其含量是保障發放品種準確的重要源頭環節。中藥化學對照品盡管是已知化合物，但由于其結構類型復雜多樣，常存在結構相近、同分異構體及立體異構體等情況，NMR 可以提供化學位移值、偶合常數、譜峰多重性等豐富信息，能夠揭示化合物的結構片段信息甚或立體結構，在中藥化學對照品結構鑒定工作中具有不可替代的作用。此外，1H-qNMR 需要樣品量少、無損、快速，可一步測定供試品含量及殘留溶劑等有關物質，是目前常用的中藥化學對照品首批品種定值佐證方法。