林下種植重樓和珠子參根際土壤與原生林地土壤特征差異△

高靜，王楠，萬修福，徐蓉蓉，關思靜，黃文靜，宋忠興，李鉑，張偉

1.陜西中醫藥大學 藥學院，陜西 西安 712046；

2.陜西中醫藥大學 陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心/秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室（培育），陜西 咸陽 712083；

3.中國中醫科學院 中藥資源中心/道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；

4.寧強縣中藥材產業發展中心，陜西 漢中 724400

森林生態系統的功能健全離不開林下植被的有序參與，養分含量、水分資源及光照強弱等能夠影響森林生態系統物種多樣性和群落穩定性的關鍵因素都會隨著林下植被的更替而發生變化[1]。已有研究通過對多個氣候區域不同林分構成下的灌木層、草本層及苔蘚層進行去除與添加植物物種試驗發現，土壤理化性質和酶活性的差異是林下植被變化導致土壤微生物群落特征改變的關鍵因素[2]。因此，探查林下植被對土壤理化性質和酶活性的調控機制，對深入了解森林生態系統的運轉模式具有重要的理論和實踐意義。本課題組前期已經對重樓和珠子參根際土壤微生物量碳、氮、磷及其生態化學計量進行了相關探索[3]，本研究通過將高海拔區域育苗的重樓和珠子參移栽到遮陰條件相似且林下植被均已去除的中海拔區域，對2 種移栽植物的根際土壤酶活性、養分含量及理化特征與中海拔區域原生林地土壤相應數據進行對比，分析2 種移栽植物對原生林地土壤特征的影響模式，為人工選擇重樓和珠子參適宜生長區域土壤劃分標準提供試驗數據和理論參考。

1 材料

1.1 樣品

試驗樣地位于陜西省西南隅秦嶺和巴山兩大山系交匯地帶的寧強縣鷹咀巖區域，此地區年平均降雨量1200 mm，年均溫13 ℃。樣地所處海拔1500 m左右，樣地主要分布樹種為白樺、麻櫟、漆樹、千金榆，華山松等，草本植物多為蒿類、白茅、莎草等。將樣地草本全部挖除后，進行重樓和珠子參的移栽工作，移栽時間選取在9 月。本試驗取樣地點集中于上層喬木為千金榆和華山松的混交地帶。實驗材料由陜西中醫藥大學陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心李鉑副教授鑒定為重樓Paris polyphyllaSm.和珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng。土壤采集于2019 年7 月上旬（當地高溫時段，土壤化學過程較為劇烈），在重樓和珠子參林下栽培周邊且未開發區域采集原生林地土壤。由于原生林地下層植物茂密，此土壤樣本不區分是否為根際土。取樣深度0～20 cm，在25 m×25 m 的區域內使用5 點法取樣，混合土樣除去植物殘體和土壤動物。統一選擇移栽苗齡3 年的重樓和珠子參根系不易抖落結合緊密的土壤部分（厚度1～3 mm）作為根際土，在連片種植區域為達到重復實驗效果，3 組土壤獲取區域間隔10 m 以上。上述土壤過2 mm 篩，置4 ℃冰箱保存待測定。

1.2 試藥

鹽酸、硫酸、甲基紅、溴甲基綠、碳酸鈉、酒石酸銻鉀、抗壞血酸、鉬酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鉀、氫氧化鈉、檸檬酸、氫氧化鉀、苯酚、甲醇、乙醇、丙酮、次氯酸鈉、硫酸銨、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、草酸鈉、高錳酸鉀、脲、硝酸鉀、硫酸銀、氫氧化鈣、碳酸鈣均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；對氨基苯磺酸和α-萘胺鹽酸鹽均為分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 儀器

Vario MACRO cube 型元素分析儀（德國Elementar公司）；K1160型凱氏定氮儀（海能未來技術集團股份有限公司）；UV-1800PC型紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；FP640型火焰光度計（上海精工科技有限公司）；Select TOC型總有機碳分析儀（德國Elementar公司）；ICAP-7200型電感耦合等離子體發射光譜儀、Micro 17R型離心機均購于美國賽默飛世爾科技公司；230T型超聲破碎儀（昆山市超聲儀器有限公司）；SpectraMax190型全波長酶標儀（美國分子儀器公司）；JCS-2000型電子天平（中國凱豐集團有限公司）；DIKW-4型水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）。

2 方法

2.1 樣品測定

土壤總碳（soil total carbon，TC）、有機碳（total organic carbon，TOC）、全氮（total nitrogen，TN）、全磷（total phosphorus，TP）、全鉀（total kalium，TK）、速效鉀（available kalium，AK）、速效磷（available phosphorus，AP）、有機質（total organic matter，TOM）、土壤微生物量碳（soil microbial biomass carbon，MBC）、土壤微生物量氮（microbial biomass nitrogen，MBN）、土壤微生物量磷（microbial biomass phosphorus，MBP）、銨態氮（NH4+-N）、硝態氮（NO3--N）采用元素分析儀、硫酸-重鉻酸鉀氧化容量法、濃硫酸消煮-凱氏定氮法、氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法、火焰光度法、重鉻酸鉀外加熱法、三氯甲烷熏蒸K2SO4法、三氯甲烷熏蒸-容量分析法、Brookes 法、分光光度法等進行測定[4-9]。土壤脲酶（urease，URE）、蔗糖酶（sucrase，SUC）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）、亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NiR）活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法、3，5-二硝基水楊酸比色法、對硝基苯磷酸鹽比色法、高錳酸鉀滴定法、酚二磺酸比色法，苯磺酸-乙酸-α萘胺比色法測定[10-14]。土壤pH、電導率（electrical conductivity，EC）和含水量（water content，WC）分別使用pH計、電導率儀和稱質量法測定。

2.2 數據統計與分析

使用主成分分析（principal component analysis，PCA）對數據進行降維處理，進行PCA 時將數據進行如下標記：TOC（X1）、TN（X2）、TP（X3）、TK（X4）、MBC（X5）、MBN（X6）、MBP（X7）、TOC∶TN（X8）、TOC∶TP（X9）、TOC∶TK（X10）、TN∶TP（X11）、TN∶TK（X12）、TP∶TK（X13）、MBC∶MBN（X14）、MBC∶MBP（X15）、MBN∶MBP（X16）、NH4+-N（X17）、NO3--N（X18）、AP（X19）、AK（X20）、pH（X21）、EC（X22）、WC（X23）、ACP（X24）、NiR（X25）、NR（X26）、CAT（X27）、URE（X28）、SUC（X29）、TC（X30）、TOM（X31）。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗各指標不同處理間的差異，最小顯著性差異法（LSD）進行多重比較，顯著性水平為P＜0.05。采用t-value 雙序圖研究土壤特征對酶活性的影響，當箭頭完全落入空白或灰色圓圈，分別代表與限定酶活性呈現顯著正相關或顯著負相關。使用冗余分析（RDA）將3 種不同來源土壤特征的多變量集中于同一坐標系中，直觀反映因子變化的貢獻差異。由于TN 與TOM、TC 與TOC 在分析時有較大的重疊，因此在t-value雙序圖與RDA 中去除TOM 與TC 數據。MBC、MBN、MBP、生態化學計量等相關分析已在本課題組前期發表文章中進行討論[3]。

3 結果與分析

3.1 不同來源土壤養分含量和理化性質比較

由圖1 可知，珠子參根際土壤TC 和TOC 質量分數顯著高于重樓根際和原生林地土壤的TC 和TOC 質量分數（P＜0.05），TC 是后兩者的1.59 倍和1.58 倍，TOC 是后兩者的1.92 倍和1.86 倍，而重樓根際和原生林地土壤的指標之間差異無統計學意義。珠子參根際土壤TN 質量分數顯著高于原生林地土壤TN 質量分數（P＜0.05），達到后者的1.36 倍；原生林地土壤TN 質量分數顯著高于重樓根際土壤TN 質量分數（P＜0.05），是后者的1.07倍。珠子參根際土壤TOM 質量分數顯著高于重樓根際和原生林地土壤TOM 質量分數（P＜0.05），分別達到后兩者的1.92倍和1.87倍，而重樓根際和原生林地土壤的指標之間差異無統計學意義。重樓根際土壤TP 質量分數顯著高于珠子參根際和原生林地土壤TP 質量分數（P＜0.05），分別達到后兩者的1.11 倍和1.14 倍，珠子參根際和原生林地土壤TP質量分數之間差異無統計學意義。重樓根際土壤AP 質量分數顯著高于珠子參根際土壤AP 質量分數（P＜0.05），達到后者的5.5 倍；珠子參根際土壤AP 質量分數顯著高于原生林地土壤AP 質量分數（P＜0.05），是后者的2.57 倍。珠子參根際土壤TK質量分數顯著高于重樓根際和原生林地土壤TK質量分數（P＜0.05），達到后兩者的1.12 倍，重樓根際和原生林地土壤TK 質量分數之間差異無統計學意義。原生林地土壤AK質量分數顯著高于珠子參根際土壤AK 質量分數（P＜0.05），達到后者的1.63 倍；珠子參根際土壤AK 質量分數顯著高于重樓根際土壤AK質量分數（P＜0.05），是后者的2.56倍。重樓根際土壤NH4+-N 質量分數顯著高于原生林地土壤NH4+-N 質量分數（P＜0.05），達到后者的1.12 倍；原生林地根際土壤NH4+-N 質量分數顯著高于珠子參根際土壤NH4+-N 質量分數（P＜0.05），是后者的1.04 倍。珠子參根際土壤NO3--N 質量分數顯著高于重樓根際土壤NO3--N 質量分數（P＜0.05），達到后者的3.74 倍；重樓根際土壤NO3--N 質量分數顯著高于原生林地土壤NO3--N 質量分數（P＜0.05），是后者的1.75 倍。由表1 可知，3 種土壤間pH、EC 及WC 差異均有統計學意義（P＜0.05），pH 為原生林地土壤＞重樓根際土壤＞珠子參根際土壤，EC 和WC 為重樓根際土壤＞珠子參根際土壤＞原生林地土壤。上述結果表明植物會通過對碳、氮、磷、鉀相關元素的獲取間接影響土壤環境，進而改變土壤性質。

表1 不同來源土壤理化性質特征（,n=3）

表1 不同來源土壤理化性質特征（,n=3）

注：不同小寫字母表示組間P＜0.05。

圖1 不同來源土壤養分相關元素質量分數（, n=3）

3.2 不同來源土壤酶活性的比較

由圖2 可知，原生林地土壤SUC 活性顯著高于重樓根際和珠子參根際土壤SUC 活性（P＜0.05），達到后兩者的1.30 倍和1.23 倍，而重樓和珠子參之間差異無統計學意義。原生林地土壤URE 活性顯著高于重樓根際土壤URE 活性（P＜0.05），達到后者的1.33 倍；重樓根際土壤URE 活性又顯著高于珠子參根際土壤URE 活性（P＜0.05），達到后者的1.22 倍。原生林地土壤CAT 活性顯著高于珠子參根際土壤CAT活性（P＜0.05），達到后者的1.19倍；重樓根際土壤CAT活性與其他2種土壤之間差異無統計學意義。原生林地土壤NiR活性顯著高于珠子參根際土壤NiR活性（P＜0.05），達到后者的1.15倍；珠子參根際土壤NiR 活性顯著高于重樓根際土壤NiR活性（P＜0.05），達到后者的1.18倍。3種土壤間的NR 和ACP 活性差異無統計學意義。酶活性差異受到植株自身生理狀態和環境條件的雙重影響，一段時間內的酶活性只能表征當前時期不同植被類型和微環境小氣候對不同酶類活動的影響。

圖2 不同來源土壤酶活性特征（, n=3）

3.3 土壤特征與酶活性的相關性

從t-value 雙序圖（圖3）可以看出，TOC∶TP和TN∶TP 與ACP 活性呈現顯著負相關關系。AK、MBC∶MBP、MBN∶MBP、TOC∶TP、TOC∶TK、TOC∶TN、TN∶TP、TN∶TK、TOC、TN、TK、NO3--N、MBN 與NiR 活性呈現顯著正相關關系，pH、MBC∶MBN、TP∶TK、NH4+-N、MBP、TP、AP、WC、EC 與NiR 活性呈現顯著負相關關系。TOC∶TP、TOC∶TK 和TN∶TP 與NR 活性呈現顯著正相關關系，MBC∶MBN、TP∶TK 與NR活性呈現顯著負相關關系。MBC∶MBN、TP∶TK與CAT活性呈現顯著正相關關系，TOC∶TP、TOC∶TK、TN∶TP、TOC、NO3--N 與CAT 活性呈現顯著負相關關系。pH、MBC∶MBN、TP∶TK、NH4+-N與URE 活性呈現顯著正相關關系，MBN∶MBP、TOC∶TP、TOC∶TN、TOC∶TK、TN∶TP、TN∶TK、TOC、NO3--N、TN、TK、MBN與URE活性呈現顯著負相關關系。沒有指標與SUC 活性表現出顯著相關性。指標間的相關關系往往會出現復雜的網狀聯系，酶活性雖然與養分含量及其相對占比有很高的關聯度，但是由于植物生長狀態及環境的不斷變化，這種關系并不一定是時刻緊密對應的。

圖3 土壤酶活性與土壤特征因子間的響應關系

3.4 土壤特征的PCA

從表2 可知，前三軸能夠解釋95.424%的變異（第一軸58.426%、第二軸33.063%、第三軸3.935%）。主成分表達式為公式（1）～（3），主成分綜合模型為公式（4）。

表2 土壤特征的方差分解主成分提取分析

式中，ZX1～ZX31是X1～X31的標準化轉換值。

主成分綜合模型得分說明，3 種土樣在養分狀態和酶反應的綜合條件下存在較大的差異（表3）。RDA 表明，重樓根際土壤特征與磷素類、NH4+-N 相關性較高，ACP 相比其他酶類有較高的參與度。珠子參根際土壤特征與大部分氮素類、TOC、TK 及NO3--N 相關性較高。原生林地土壤則是AK、SUC、URE、NiR、CAT較為活躍（圖4）。

圖4 不同來源土壤特征的RDA

4 討論

根際是土壤養分流動與植物營養生理生態過程有機結合的重要區域。在本研究中，珠子參根際土壤TC 和TN 均高于重樓根際土壤和原生林地土壤。結合TOC 和TOM 數據可以推斷，TOC 占比能夠決定TC 總量，而TOM 對TN 含量上升具有較高的貢獻。大量研究通過對不同地貌環境（山區、沙地、平原等）差異性植被類型（草地、作物、森林等）根際及土壤養分進行分析，同樣得出TOC 與TC、TOM 與TN 間存在顯著正相關關系[5,15-18]。林下移栽過程中深松處理屬于保護性耕作，在此過程中的人為活動和耕作擾動使更多CO2和風積灰塵進入土壤，影響了土壤氮素的平衡和遷移轉化，產生碳、氮元素表層富集效應[18]，有利于淺根系植物的吸收。在本研究中，珠子參根際土壤TC 和TN 較高的原因可能是其相比于重樓對表層土壤碳、氮養分的利用率更高。有研究報道，通過對檸條Caragana korshinskiiKom.、短花針茅Stipa brevifloraGriseb.和蒙古冰草Agropyron mongolicumKeng 進行比較，發現根際與非根際TC 和TN 的含量存在不規律的變化形式，成因復雜，可能由植被差異介導的地表水資源匯流及再分配過程和根系對土壤理化性質及微生物種群的調節能力不同等方面原因導致[4]。根際土壤氮素含量既可以由根部土層養分決定，也可以被凋落物所含養分影響。然而，杉木Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.、林下中華鱗毛蕨Dryopteris chinensis（Bak.）Koidz.、淡竹葉Lophatherum gracileBrongn.、毛冬青Ilex pubescensHook.et Arn.和紫珠Callicarpa bodinieriLevl.等植物根際與非根際氮素含量被凋落物的差異化影響則說明，雖然凋落物也是林下土壤養分的主要來源之一，但凋落物所含養分的遷移是一個極其復雜的生態現象，有可能經歷多次富集和再釋放過程[19]。在本研究中，重樓根際土壤TP 和AP 均高于珠子參根際土壤和原生林地土壤。森林土壤磷素主要來源于礦物質風化，因此較難得到補充。磷素有向根際遷移的趨勢，但是由于環境條件和植物吸收與轉化能力差異，根際與非根際土壤磷素相對含量也隨之變化[20]。對本試驗樣地分析后發現，珠子參種植密度大、間隙小，而重樓種植密度小且形態高瘦，由此可見，磷素的種間差異可能與淋溶程度有關[6]。鉀離子移動性較強，AK 易受土壤質地和地形的影響[21]，林下物種的差異加劇了本研究中AK含量的變化。

土壤酶來源廣泛，植物根系、微生物及動物殘體均能產生，且土壤中的多數生物化學與土壤環境運行、發展與轉變過程均有土壤酶的參與[22-23]。由于土壤酶能轉變固定態土壤養分，加速土壤有效態養分釋放，因此土壤酶活性成為土壤肥力高低的衡量標準之一。土壤酶活性受到生物（植物、微生物與動物）和非生物（土壤水分、溫度與理化性質）的綜合影響[24]。在本研究中，重樓和珠子參根際土壤SUC 活性較為接近，但兩者URE 活性差異較大。李毳等[11]對比了遠志Polygala tenuifoliaWilld.和北柴胡Bupleurum chinenseDC.的根際土壤SUC 和URE的活性，也得到了與本研究相同的結果。土壤SUC能將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，以便于植物和微生物吸收利用[22]。SUC 還能促進土壤易溶性營養物質增加，有利于為土壤微生物提供TOC，提高土壤微生物活性[13]。土壤URE 的酶促反應只能酶解尿素轉變為氨，其活性與土壤氮素含量具有一定關聯[23]。在本研究中，重樓根際土壤TN含量低于珠子參的現象可能暗示重樓對氮素的需求更大，導致微生物代謝更為活躍，這一點也可以被重樓根際土壤MBC含量較高所驗證[3]，所以造成重樓根際土壤URE 活性提高。土壤ACP 能對磷素進行分解，促進有機磷礦化，當解磷微生物感知環境磷素含量降低這一信號時，會以胞吐形式向土壤釋放ACP，側面幫助植物獲得磷素[13]。然而，在本研究中ACP 活性高低與TP、AP 并沒有直接的對應關系。SUC、URE 和ACP 是土壤中碳、氮和磷素流動與循環的關鍵酶，其活性大小時常受到土壤養分水平、微生物組成結構和植物生長狀態的相互影響，因此ACP 活性與TP、AP含量的復雜關系及如何受到其他環境因素制約還需要進一步研究。過氧化氫類物質會對植物的生長發育產生危害，而CAT 能有效破壞土壤中這類物質[22]。有研究證實，CAT 活性和土壤有機質積累程度也有關聯[25]。但也有文章和本研究結果類似，指出氮素含量不一定會影響到CAT 活性，由此可見氮素的轉運效率差異也起到一定作用[20]。向土壤中添加肥料對NR活性通常有激活作用[25]，然而也有研究證實毛竹Phyllostachys edulis（Carriere）J.Houzeau 原生林帶土壤NR 活性最高且人工外源施加氮素對土壤NR活性具有顯著抑制作用[13]。由于不同植被類型的根系形狀和生理過程不同，引起土壤理化性質和微生物群落的改變，不同的反硝化作用體現差異化的土壤NR活性[26]。另一方面，底物和不同酶抑制物含量及底物分解速率是影響NR和NiR在氮素轉化環節上相互關系的重要因素[27]。在本研究中，3 種土壤NR 活性差距不大，但NiR 活性表現出較大差異，可能是前期不同土壤NR 均能夠促進反硝化作用，為NiR 提供了不同的底物數量[27]，而此時的NR卻因元素轉化周期活性降低。此外，在本研究中原生林地土壤的6 種酶都保持不低的活性，可以表明植被物種多樣性對酶活性具有一定的調節能力，能夠有效提高土地生產力，增強生態系統組分的功能[28]。

土壤酶活性、養分含量和理化性質受到植被類型的顯著影響，正、負響應均有發生。根據由主成分表達式得到的F1、F2、F3值和主成分綜合模型得到的F值可以認為，本研究中的3 種土樣在酶活性、養分含量和理化性質方面存在差異，重樓和珠子參移栽后對原生林地土壤特征的影響方向不同。在本研究中，RDA 顯示重樓根際的磷素響應和珠子參根際的碳氮反應較為突出，而原生林地土壤的酶活性更加顯著。本研究中3 種土樣的SUC、URE、ACP活性與碳、氮、磷素含量變化不一致、相關性不顯著的問題可能與移栽物種在適應新環境過程中能表現出類似入侵植物的特征，改變了養分循環效率有關[29]。通常，成熟林帶土壤酶活性較高，這與本研究中原生林地土壤情況類似。然而，有研究表明，雖然近熟林酶促底物略有欠缺，但其部分酶活性和養分含量高于成熟林，原因歸結于物種年輕、發育迅速且有效養分比重相對較高[30]。這一點也在本研究中重樓和珠子參的根際土壤中有所表現。因此，酶活性與養分含量相關性的變化，由植被組成、物種年齡、環境條件、采樣時間等限制。此外，根部生理作用的周期變化也會帶來酶活性與養分含量的劇烈變化，導致重樓與珠子參根際土壤養分相較于原生林地出現富集作用。本研究中RDA 結果顯示，重樓、珠子參與土壤養分、酶活性的正、負相關關系和土壤p 值具有較大的關聯。有研究也表明，常綠闊葉林下的土壤pH和養分含量適合重樓、珠子參的生長[31-32]，且2 種植物的次生代謝產物與生長特性均與土壤養分含量呈現顯著相關關系[33-36]。寧強縣屬于多雨氣候類型地區，更應注意土壤養分的存在形式，NH4+-N有助于保護土壤肥力，NO3--N在潮濕的環境下容易流失，而NO3--N 增多伴隨的土壤pH 降低對硝化細菌有抑制作用，影響酶活性[37]。

土壤特征與植被類型是一個相互影響的過程。與原生林地相比，進行林下種植后的土壤由于物種改變導致的養分需求變化必然會帶來酶活性的差異。因此，應開展林下種植適應性研究，針對不同藥用植物特征展開相應撫育工作，根據藥用植物生長需求選擇相應原生林地類別，縮短藥用植物移栽后的適應周期，推動藥用植物生態種植發展。