響應面法優化胡黃連苷Ⅱ硅膠柱色譜純化工藝△

畢艷艷，郝大偉a，代立平，唐偉銘，龍瑞，沈慶國*

1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；

2.中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006

胡黃連是玄參科植物胡黃連Picrorhiza scrophulariifloraPennell 的干燥根莖，主要分布于我國西藏、云南和四川的高原地區。近年來，國內外的研究發現，胡黃連中有效成分主要為環烯醚萜苷（胡黃連苷）類、葫蘆素類及酚苷類，其具有保肝利膽、抗腫瘤、抗糖尿病等多種功效[1]。胡黃連苷以胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ為主要有效成分，《中華人民共和國藥典》2020 年版相關內容規定，西藏胡黃連中胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ的總量不得少于9.0%[2]；其中，胡黃連苷Ⅱ含量最高，為最主要成分，且具有廣泛藥理活性，對肝臟、大腦、心臟、腎臟有顯著的保護作用，具有抗氧化、抗炎、平喘等功效[3-4]。

硅膠柱色譜是天然產物分離最常用的方法之一，但常規裝柱采用常壓敞口色譜柱，具有柱床松散、樣品載樣量小、重現性差、分離速度慢、生產周期長、使用溶劑多、有機溶劑揮發污染環境等缺點，而高壓色譜柱能避免常壓色譜柱的不足，已被廣泛用于食品、醫藥、農業等領域[5-7]。本實驗引入高壓硅膠色譜柱的中低壓色譜技術，運用Box-Behnken響應面法設計原理，采用薄層色譜和高效液相色譜法（HPLC）進行定性定量分析，以胡黃連苷Ⅱ質量分數、回收率為評價指標，探討硅膠柱色譜純化胡黃連苷Ⅱ最佳工藝條件，為胡黃連苷Ⅱ開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

DF-60-A 型水冷雙級高速齒輪傳動粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；1260 型高效液相色譜儀（Agilent公司）；R-300 型旋轉蒸發器（瑞士Buchi公司）；DLSK-10/30 型低溫冷卻液循環泵（鄭州科泰試驗設備有限公司）；XS204 型電子分析天平（Mettler-Toledo公司）；Prep200型高壓制備液相系統（上海賽梵科分離技術有限公司）；DAC-50 型上樣柱（上海賽梵科分離技術有限公司，650 mm）；DAC-50 型色譜柱（上海賽梵科分離技術有限公司，1300 mm）。

1.2 試藥

對照品胡黃連苷Ⅰ（批號：111727-201702，純度：95.6%）；胡黃連苷Ⅱ（批號：111596-201805，純度：93.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；三氯甲烷（金嶺化工股份有限公司，批號：20190219，工業級）；硅膠300～400 目（青島海洋化工有限公司，批號：19021030333）；甲醇（兗礦國宏化工有限公司，批號：20191218，工業級）；高效液相用試劑均為色譜純；分析用試劑均為分析純。

胡黃連（產地為西藏自治區，批號：190401）經中藥制藥共性技術國家重點實驗室范建偉高級工程師鑒定為玄參科植物胡黃連Picrorhiza scrophulariifloraPennell的干燥根莖。

2 方法

2.1 胡黃連苷Ⅱ質量分數測定

2.1.1 HPLC 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（35.0∶65.0∶0.1）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：275 nm；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取胡黃連苷Ⅱ對照品適量，加甲醇制成含胡黃連苷Ⅱ0.268 mg·mL-1的溶液，即得對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液5 mL 置于20 mL 量瓶中，加甲醇稀釋定容至至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取各供試樣品30 mg置于50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，冷卻并定容至刻度，搖勻，得供試品儲備液。精密吸取供試品儲備液5 mL 置于25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 繪制標準曲線 分別精密移取2.1.2 項下對照品溶液1、2、4、5、8、10 mL置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，按2.1.1項下條件進樣測定，記錄峰面積值。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，并計算線性回歸方程，胡黃連苷Ⅱ：Y=14 281 948.778X-13 408.559（r=0.999），線性范圍為0.013 4～0.134 0 mg·mL-1。

2.2 拌樣硅膠制備

稱取定量已知質量分數的胡黃連粗粉，按照料液比為1∶20加入95%乙醇，提取3次，提取總時間為4.5 h，合并提取液，濾過，濃縮至適量，得胡黃連浸膏[8-10]。按藥材-硅膠質量比為3∶1稱取300～400目硅膠，與胡黃連浸膏混勻拌樣，干燥粉碎，得拌樣硅膠，采用HPLC測定胡黃連苷Ⅱ質量分數。

2.3 硅膠柱色譜

稱取定量300～400 目硅膠，加入流動相三氯甲烷-甲醇，超聲30 min，將硅膠勻漿液緩慢加入色譜柱中，開啟氣壓，緩慢壓實，啟動流動相泵平衡色譜柱。

稱取2.2項下制備的拌樣硅膠，加入流動相三氯甲烷-甲醇，超聲30 min，將拌樣硅膠勻漿液緩慢加入上樣柱中，將上樣柱與色譜柱串聯，開啟氣壓，緩慢壓實。啟動流動相泵進行洗脫，同時采集色譜圖，待目標峰出現后，收集洗脫液，每30 min 收集一段，蒸干各段洗脫液，采用HPLC 測定胡黃連苷Ⅱ質量分數，去除峰前峰后質量分數較低的各段，合并質量分數較高的各段，得目標產品（質量分數＞40%）。通過公式（1）計算胡黃連苷Ⅱ的回收率。

式中，R為胡黃連苷Ⅱ的回收率；m1為產品的質量；w1為產品中胡黃連苷Ⅱ的質量分數；m2為拌樣硅膠的質量；w2為拌樣硅膠中胡黃連苷Ⅱ的質量分數。

2.4 單因素試驗

2.4.1 洗脫劑三氯甲烷-甲醇比例的確定 根據相關文獻報道及前期預試驗，兼顧溶劑之間的極性、后續溶劑回收利用，本實驗選取三氯甲烷-甲醇的溶劑體系作為洗脫劑[11-12]。

洗脫劑對目標產物的洗脫分離效果決定了目標產物的質量分數和回收率。本實驗采用薄層色譜法對胡黃連苷Ⅱ的洗脫劑三氯甲烷-甲醇比例進行考察。吸取同體積樣品和對照品點樣在同一硅膠板上（5份），待溶劑揮干后，分別放置到已配置飽和的不同比例洗脫劑的展缸中，洗脫劑三氯甲烷-甲醇比例分別為4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1，待洗脫劑展開至10 cm 左右取出，揮干洗脫劑，顯色，觀察。計算目標產物在不同洗脫劑比例中比移值（Rf）。

2.4.2 色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比的確定 按照色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比為1∶1、1.4∶1.0、1.7∶1.0、2∶1、2.4∶1.0 分別稱取按照2.2 項下方法制備的拌樣硅膠、色譜硅膠裝柱，經三氯甲烷-甲醇比例為6∶1進行洗脫，洗脫流速為6 mL·min-1，分段收集，蒸干各段洗脫液，采用HPLC 測定胡黃連苷Ⅱ質量分數，計算最終產品胡黃連苷Ⅱ質量分數、回收率。

2.4.3 洗脫流速的確定 按照色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比為1.7∶1.0分別稱取按照2.2項下制備拌樣硅膠、色譜硅膠裝柱，經三氯甲烷-甲醇（6∶1）進行洗脫，洗脫流速分別為4、6、7、8、10 mL·min-1，分段收集，蒸干各段洗脫液，采用HPLC 測定胡黃連苷Ⅱ質量分數，計算最終產品胡黃連苷Ⅱ質量分數及回收率。

2.5 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，根據響應面法設計原理[7,13-14]，以洗脫劑三氯甲烷-甲醇比例（A）、色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比（B）、洗脫流速（C）為響應因素，以胡黃連苷Ⅱ質量分數（R1）、回收率（R2）、綜合評分（R綜）為響應值，進行三因素三水平的響應面分析試驗，設計了17 個試驗點，篩選各因素的最優條件。

因胡黃連苷Ⅱ的質量分數和回收率具有相關性，質量分數增大會導致其回收率的降低，反之亦然。在保證胡黃連苷Ⅱ質量分數＞40%的前提下，盡可能提高其回收率，因此，胡黃連苷Ⅱ質量分數和回收率2個指標所占權重分別為60%、40%，其加權后的綜合評分為質量分數和回收率2 個指標得分之和。胡黃連苷Ⅱ柱色譜純化工藝綜合評價指標見表1。

表1 胡黃連苷Ⅱ柱色譜純化工藝綜合評價指標

3 結果與討論

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 洗脫劑三氯甲烷-甲醇比例的確定 洗脫劑三氯甲烷-甲醇比例分別為4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1，胡黃連苷Ⅱ展開的Rf見表2，洗脫劑比例小，洗脫劑極性較強，化合物移動的速度越快，洗脫分離效果較差；洗脫劑比例大，洗脫劑極性低，洗脫所需的時間長，消耗洗脫劑增多，且三氯甲烷毒性較大，生產成本提高。因此，選擇洗脫劑三氯甲烷-甲醇5∶1、6∶1、7∶1為響應因素考察范圍。

表2 不同洗脫劑比例胡黃連苷Ⅱ展開的Rf

3.1.2 色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比的確定 按照色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比為1∶1、1.4∶1.0、1.7∶1.0、2∶1、2.4∶1.0 稱取硅膠裝柱，胡黃連苷Ⅱ質量分數和回收率結果見表3。

表3 不同色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比胡黃連苷Ⅱ質量分數和回收率

結合生產需要，為得到質量分數較高目標產品，當上樣樣品質量已定，色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比小時，色譜硅膠用量少，會出現超載，造成分離純化效果差，使胡黃連苷Ⅱ回收率較低；隨著色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比增大，色譜硅膠用量增多，柱徑高比增加，胡黃連苷Ⅱ質量分數不斷增大，回收率也增大；但色譜硅膠用量太多，會引起有效成分殘存在硅膠上，使實際回收率下降，且生產成本會提高。綜合考慮，選擇色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比1.4∶1.0、1.7∶1.0、2∶1 為響應因素考察范圍。

3.1.3 洗脫流速的確定 經三氯甲烷-甲醇洗脫，洗脫流速分別為4、6、7、8、10 mL·min-1，胡黃連苷Ⅱ質量分數和回收率結果見表4。

表4 不同洗脫流速胡黃連苷Ⅱ質量分數和回收率

當洗脫流速太低時，導致軸向擴散，使柱色譜分離純化效果變差，胡黃連苷Ⅱ質量分數、回收率較低，且所需要的時間長；當洗脫速度太大時，兩相間的濃度難以分配平衡，洗脫劑未能對被洗脫物進行充分洗脫，造成胡黃連苷Ⅱ質量分數、回收率也較低，且消耗洗脫劑會增多。結合生產需要，為得到質量分數較高目標產品，綜合考慮選擇洗脫流速為6、7、8 mL·min-1為響應因素考察范圍。

3.2 響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，響應面優化胡黃連苷Ⅱ柱色譜純化工藝的因素水平設計見表5，Box-Behnken響應面優化胡黃連苷Ⅱ柱色譜純化工藝方案設計及結果見表6，Box-Behnken響應面優化胡黃連苷Ⅱ柱色譜純化工藝二次回歸方程方差分析結果見表7。

表5 響應面優化胡黃連苷Ⅱ柱色譜純化工藝的因素水平設計

表6 Box-Behnken響應面優化胡黃連苷Ⅱ柱色譜純化工藝設計方案及結果

表7 Box-Behnken響應面優化胡黃連苷Ⅱ柱色譜純化工藝二次回歸方程方差分析結果

利用Design-Expert v 8.0.6 軟件對表6 中的數據進行二次多元回歸擬合，R綜對各因素的二次多項回歸模型方程為R綜=-755.96+156.91A+329.27B+30.64C-4.34AB-0.50AC+0.85BC-12.68A2-88.30B2-2.32C2，決定系數R2=0.993 9。

由表7 結果，對R綜，回歸模型P＜0.01，說明回歸模型極顯著，模型成立；A、B、A2、B2、C2因素P＜0.01，交互項AB的P＜0.05，差異有統計學意義；失擬項P＞0.05，說明失擬項差異無統計學意義，提示回歸方程擬合度良好，可用于分析與預測。各因素對R綜值的影響大小順序為A＞B＞C。

3.3 響應面模型分析

利用Design-Expert v 8.0.6軟件得到二次回歸方程的響應面圖，以此評價實驗各因素之間的交互強度，以確定最佳純化工藝參數。結果見圖1～3。

等高線越接近橢圓形或響應面線越陡峭說明這2 種交互因素對響應值影響越顯著，反之，不顯著。由圖1～3 可知，色譜硅膠-上樣樣品質量比和洗脫劑比例對R綜的影響差異有統計學意義，洗脫劑比例和洗脫流速及色譜硅膠-上樣樣品質量比和洗脫流速對R綜的影響差異無統計學意義。

圖1 色譜硅膠-上樣樣品質量比和洗脫劑比例對R綜的響應面和等高線圖

圖2 洗脫劑比例和洗脫流速對R綜的響應面和等高線圖

利用Design-Expert v 8.0.6軟件優化得到最佳柱色譜純化工藝∶洗脫劑三氯甲烷-甲醇為5.88∶1.00，色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比為1.74∶1.00，洗脫流速為6.85 mL·min-1，胡黃連苷Ⅱ質量分數為55.41%，回收率為93.65%，R綜為98.48。結合實際所需，最終確定最佳工藝：洗脫劑三氯甲烷-甲醇為6∶1，色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比為1.7∶1.0，洗脫流速為7 mL·min-1。

3.4 驗證實驗

按照上述最佳工藝條件：洗脫劑三氯甲烷-甲醇比例為6∶1，色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比為1.7∶1.0，洗脫流速為7 mL·min-1，完成3 批驗證實驗，得到胡黃連苷Ⅱ質量分數、回收率平均值分別為54.99%、93.59%，RSD 分別為1.33%、1.17%；R綜平均值為98.62。結果提示，優化得到硅膠柱色譜純化胡黃連苷Ⅱ工藝穩定可靠。

4 結論

本實驗通過Box-Behnken 響應面法優化得到胡黃連苷Ⅱ硅膠柱色譜純化最佳工藝：洗脫劑三氯甲烷-甲醇比例為6∶1，色譜硅膠-上樣樣品（原藥材）質量比為1.7∶1.0，洗脫流速為7 mL·min-1。該方法操作簡單、穩定性好、節省成本，胡黃連苷Ⅱ質量分數、回收率較高，為將來胡黃連苷Ⅱ作為原料藥投入大生產提供一定參考價值。