小兒消積止咳提取過程中近紅外定量模型研究△

李因坤，魏瑞霞，2a，李艷芳，2，范建偉，2，劉慶豐，2，關(guān)永霞，2*

1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；

2.魯南制藥集團股份有限公司/中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276006

小兒消積止咳口服液是由炒山楂、檳榔、枳實、瓜蔞、連翹等10 味中藥加工制成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱肅肺、消積止咳的功能[1]，可用于小兒支原體肺炎[2]、小兒咳嗽變異性哮喘[3]、小兒上呼吸道感染后咳嗽[4]等疾病的治療，臨床療效確切。

小兒消積止咳口服液生產(chǎn)過程由提取、濃縮、醇沉等多個工序組成。提取作為工業(yè)化生產(chǎn)的首要環(huán)節(jié)，目的在于將中藥飲片中有效成分轉(zhuǎn)移到溶媒中，確保有效成分在規(guī)定范圍內(nèi)。因此，提取環(huán)節(jié)直接影響著藥品的質(zhì)量與療效[5]。在實際生產(chǎn)中，常存在批間有效成分含量波動大的問題，原因在于提取環(huán)節(jié)的控制仍以人工主觀判斷和離線檢測分析為主，其結(jié)果常嚴重滯后，無法進行有效的數(shù)據(jù)跟蹤及分析。近紅外（NIR）光譜能夠確切反映提取過程中物料有效成分的溶出狀態(tài)，更好地監(jiān)控提取過程的質(zhì)量波動，是目前主流的過程分析技術(shù)工具之一[6-8]，已有學者為保證藥品質(zhì)量穩(wěn)定性，將NIR 技術(shù)應(yīng)用于中藥的提取過程[5,9]。

本研究模擬小兒消積止咳提取過程，收集多批提取液中共116 個樣品，采用傅里葉變換NIR 光譜儀結(jié)合積分球漫反射方式對樣品進行NIR 光譜的采集，并應(yīng)用偏最小二乘法（PLS）將高效液相色譜法（HPLC）定量分析結(jié)果與NIR光譜相關(guān)聯(lián)，建立辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷和連翹苷4個成分的NIR定量分析模型，以預(yù)測未知樣品中4 個成分的含量，從而為實現(xiàn)小兒消積止咳口服液提取過程的質(zhì)量監(jiān)控提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695 型高效液相色譜儀（美國沃特世公司），配有2998 型二極管陣列檢測器（PDA）、Epower 3色譜工作站；MPA Ⅱ型多功能傅里葉變換NIR 光譜儀（德國布魯克公司），配有OPUS 8.1 光譜采集和處理軟件；H1650-W 型臺式微量高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；KS-5200DE型液晶超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）；TNH-200型提取罐（溫州市金榜輕工機械有限公司）。

1.2 試藥

對照品辛弗林（批號：110727-201809，純度：99.5%）、連翹苷（批號：110821-201816，純度：95.1%）、柚皮苷（批號：110722-201815，純度：91.7%）、新橙皮苷（批號：111857-201804，純度：99.4%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純（美國天地有限公司）；高氯酸為分析純（南京化學試劑股份有限公司）；水為超純水。

實驗用藥材經(jīng)魯南制藥集團有限公司范建偉高級工程師鑒定為正品，來源見表1，均符合《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版一部相關(guān)項下要求。

表1 小兒消積止咳口服液藥材產(chǎn)地及廠家

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品收集

分別取山楂、檳榔等10 味中藥，按照實際生產(chǎn)工藝對其進行加工炮制。參照《中國藥典》2020 年版（一部）中“小兒消積止咳口服液”【處方】項，按其制劑處方10 倍量，分別稱取所需飲片，順序投入200 L 提取罐中，加水煎煮2 次，待藥液沸騰后，調(diào)小蒸氣，保持微沸狀態(tài)。從沸騰開始取樣，每隔10 min放藥取樣1次，每次100 mL，經(jīng)300目電力紡濾過，分別在煎煮第一汁時取樣16 次，第二汁時取樣13次。重復(fù)4個批次，共得到116份提取過程中的樣品溶液。

2.2 NIR光譜的采集

取2.1項下的樣品溶液各40 mL，于直徑為51 mm石英杯中，置小型樣品旋轉(zhuǎn)器內(nèi)，采用NIR 光譜儀以積分球漫反射方式采集各樣品的原始光譜，掃描的光譜范圍為12 500～4000 cm-1，掃描數(shù)64 次，分辨率16 cm-1。為保證樣品的穩(wěn)定性，自取樣至檢測完畢，整個過程保證在30 min 以內(nèi)，所得NIR 原始光譜圖見圖1。

圖1 小兒消積止咳提取液的NIR光譜圖

2.3 辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷和連翹苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Luna?PFP（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 為0.1%高氯酸，流動相B 為乙腈-甲醇（9∶1），梯度洗脫（0～5 min，100%A；5～10 min，100%～98%A；10～15 min，98%～95%A；15～35 min，95%～80%A；35～55 min，80%～75%A；55～80 min，75%～60%A；80～81 min，60%～100%A；81～90 min，100%A）；柱溫為35 ℃；進樣量為10 μL；流速為0.8 mL·min-1；檢測波長為225 nm。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品辛弗林16.70 mg、柚皮苷24.03 mg、新橙皮苷15.53 mg和連翹苷21.78 mg，置于同一25 mL 量瓶中，加入50%甲醇，超聲溶解，作為混合對照品儲備液。精密移取上述混合對照品儲備液各1 mL置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得對照品溶液。

2.3.2.2 供試品溶液的制備 供試品溶液Ⅰ：取2.1項下第一汁水煎煮液樣品各5 mL置于10 mL量瓶中，加超純水稀釋至刻度，以轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1高速離心10 min（離心半徑為63.4 mm），取上清液，用0.22μm微孔濾膜濾過，即得。供試品溶液Ⅱ：取2.1 項下第二汁煎煮液樣品以轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1高速離心10 min（離心半徑為63.4 mm），取上清液，用0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.2.3 陰性溶液的制備 按小兒消積止咳口服液中藥材的提取方法分別制成不含枳實與連翹的煎煮液，按供試品溶液Ⅰ、供試品溶液Ⅱ的制備方法制成陰性溶液Ⅰ和陰性溶液Ⅱ。

2.3.3 方法學考察

2.3.3.1 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑，對照品溶液，供試品溶液Ⅰ、供試品溶液Ⅱ，陰性溶液Ⅰ、陰性溶液Ⅱ各10μL，按2.3.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖（圖2）。結(jié)果供試品色譜中辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷、連翹苷的色譜峰與對照品色譜峰保留時間一致，且各有效成分的色譜峰與其相鄰其他成分的分離度均大于1.5，空白溶劑與陰性溶液在待測色譜峰相應(yīng)保留時間處均無干擾。

圖2 小兒消積止咳各溶液的HPLC圖

2.3.3.2 精密度試驗 精密吸取2.3.2.1 項下的對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6 次，測得辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷、連翹苷的色譜峰保留時間RSD 分別為0.05%、0.04%、0.04%、0.03%，其色譜峰峰面積的RSD 分別為0.09%、0.18%、0.22%、0.07%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.3.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密移取2.3.2.1 項下的混合對照品儲備液0.04、0.08、0.20、0.40、0.80、2.00、4.00、8.00 mL 置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。精密吸取各混合對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，依法測定，以峰面積為縱坐標（Y），以各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），得各指標成分的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 小兒消積止咳提取液4個指標成分的線性關(guān)系

2.3.3.4 重復(fù)性試驗 取同一第一汁煎煮液樣品，按2.3.2.2項下方法平行配制6份供試品溶液并依法測定。結(jié)果顯示，辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷、連翹苷含量的RSD 分別為0.12%、0.90%、0.54%、0.30%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.3.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液Ⅰ，分別精密吸取配制后0、3、6、9、12 h的供試品溶液10μL，注入色譜儀中，測得各成分的峰面積，計算辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷、連翹苷峰面積的RSD分別為0.33%、0.11%、0.07%、0.62%。表明供試品溶液Ⅰ在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3.6 加樣回收率試驗 精密量取6 份已知含量的第一汁煎煮液樣品2.5 mL，分別加入相當量的對照品儲備液，按照2.3.2.2 項下方法配制供試品溶液，進行加樣回收率試驗。測得的辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷、連翹苷的平均回收率分別為101.5%、98.63%、101.3%、91.02%，RSD 分別為0.52%、1.6%、1.3%、0.71%，表明該方法的準確度良好。

2.3.4 樣品測定 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以外標法計算含量，結(jié)果見表3。

表3 小兒消積止咳提取液提取過程中4個指標成分的含量測定結(jié)果

2.4 NIR光譜定量分析模型的建立與優(yōu)化

以HPLC 測得的指標成分含量作為化學真值，代入OPUS 8.1定量處理軟件與NIR掃描得到的譜圖相對應(yīng)，采用Kennard-Stone 法將116 個樣本的75%作為校正集，其余25%為驗證集，進行PLS 定量分析，建立NIR 光譜與辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷、連翹苷4 個成分的定量校正模型。同時作交叉驗證，并以交叉驗證均方根誤差（RMSECV）和內(nèi)部交叉驗證決定系數(shù)（Rν2）作為評價參數(shù)，RMSECV 越小，Rν

2越大，則模型越穩(wěn)定，預(yù)測性能越好[10]。采用預(yù)測集進一步檢驗?zāi)Ｐ偷念A(yù)測能力，其評價參數(shù)為預(yù)測均方差（RMSEP）、外部驗證決定系數(shù)（Rp2）和RPD，當相對預(yù)測偏差（RPD）＞3%時認為模型具有較好的預(yù)測能力，可以進行指標的定量控制[11]。

2.4.1 光譜預(yù)處理方法選擇 由于NIR 光譜得到的光譜信息里包含了過多冗余信息，為提高分析模型預(yù)測的精度，消除噪音、雜散光、儀器及樣品狀態(tài)等各種因素的干擾。在建模過程中，采用OPUS 8.1軟件中自帶的優(yōu)化功能對無光譜預(yù)處理、消除常數(shù)偏移值、矢量歸一化（SNV）、最小-最大歸一化、多元雜散光校正、一階導(dǎo)數(shù)、一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正（SMC）、減去一條直線8 種不同的光譜預(yù)處理方法進行合理的選擇，以降低上述干擾的影響，提高模型的穩(wěn)定性。

2.4.2 光譜波段的選擇 透射光譜法多指短波NIR區(qū)，其波數(shù)一般為14 000～9000 cm-1，而反射光譜法多指長波NIR區(qū)，其波數(shù)一般在9000～4000 cm-1。小兒消積止咳煎煮液樣品是采用積分球漫反射方式采集的NIR 光譜，在光譜波段的選擇中，雖然檢測樣品為液體，同時兼具透射和反射，但因提取液為渾濁液，光譜仍以反射波段為主。另外光譜在6944、5155 cm-1附近形成2大“水峰”，即5500～4000、7500～6500 cm-1波段[11]，所以還應(yīng)盡可能避免采用上述2個波段進行NIR光譜分析。

2.4.3 最佳模型的建立 經(jīng)過不同光譜預(yù)處理方法和不同建模波段對樣品中辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷、連翹苷含量模型進行對比研究，并剔除異常樣品，得出最佳的光譜預(yù)處理方法、建模波段，建立4 個成分的定量分析模型，結(jié)果見表4，其中評價指標RMSECV 均較小，Rv2均大于0.95，說明模型性能良好。

表4 小兒消積止咳提取液NIR光譜預(yù)處理和波段選擇結(jié)果

2.4.4 外部檢驗驗證 采用所建模型對驗證集樣品中4 個成分含量的預(yù)測結(jié)果進行外部驗證，外部檢驗集由116 個樣品中規(guī)律抽取而成，每個成分含量的檢驗均采集數(shù)據(jù)28 個。預(yù)測顯示，辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷和連翹苷的Rp2分別為0.968 3、0.968 1、0.959 5和0.951 1，RMSEP分別為0.006 4、0.028 8、0.050 1 和0.003 2，RPD 分別為9.99%、5.97%、5.19%、4.13%，均大于3%，可滿足提取過程中含量預(yù)測的精度要求。

將NIR 光譜模型預(yù)測值與HPLC 實測值進行比較，結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出，模型的預(yù)測值與實測值非常接近，變化趨勢一致，表明采用NIR光譜模型對小兒消積止咳提取過程中辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷、連翹苷的含量預(yù)測結(jié)果可靠。同時，預(yù)測結(jié)果反映了小兒消積止咳提取過程中成分的溶出規(guī)律，在提取過程中，枳實中的3 個成分呈快速平衡狀態(tài)，而連翹的成分在溶液中溶出相對較慢，其原因可能與枳實、連翹的加工方式有關(guān)。

圖3 小兒消積止咳提取液4個批次中4個成分預(yù)測值與實測值的比較

3 討論

小兒消積止咳提取過程NIR 定量分析模型的建立，是利用PLS 將NIR 光譜與HPLC 分析數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)，HPLC分析數(shù)據(jù)越準確，NIR模型的準確度越高。因此，HPLC 分析方法色譜條件的選擇非常重要。在色譜條件的選擇中，以五氟苯基（PFP）柱為色譜柱，分別考察了乙腈-水、甲醇-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-甲醇-0.1%高氯酸水溶液等多種流動相，綜合分離度、保留強度、分析時間等因素，最終選取乙腈-甲醇-0.1%高氯酸水溶液為流動相，避免了測定辛弗林時常采用的流動相中添加離子對試劑的模式，防止離子對試劑及色譜柱造成不可逆?zhèn)Γ瑴p少色譜柱的平衡時間，同時使辛弗林在色譜柱上的保留增強，成功實現(xiàn)了HPLC 對小兒消積止咳提取過程中辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷和連翹苷4 個指標成分含量的同時測定。通過PDA對對照品混合液進行190～400 nm全波長掃描，結(jié)果顯示，在225 nm 處4 個成分均有較大吸收，靈敏度較高、基線較平穩(wěn)，故選擇225 nm作為吸收波長。

研究中為了更接近工業(yè)生產(chǎn)過程，在提取時應(yīng)用多功能提取罐，并以制劑處方量10 倍量進行提取。由于水提取液為渾濁液，使得NIR 光不能完全穿透樣品，因此，選取漫反射方式進行光譜掃描。在建模過程中，柚皮苷、新橙皮苷無需進行光譜預(yù)處理，辛弗林和連翹苷僅需進行消除常量偏移值的光譜預(yù)處理，即可實現(xiàn)提高模型穩(wěn)定性的目的，可見，采用積分球漫反射方式掃描光譜圖比較適合小兒消積止咳提取過程中4 個成分建模的要求。在模型評價指標中，RMSECV 和RMSEP 較為接近，代表建模樣品及驗證樣品均具有代表性，模型信息擬合較佳，與HPLC 分析方法的準確度相當。

小兒消積止咳口服液由10 味中藥配伍而成，提取中所有飲片一起煎煮，成分復(fù)雜，《中國藥典》2020 年版中小兒消積止咳口服液項下質(zhì)量控制方法僅以辛弗林為指標性成分進行了含量測定[12]，較難滿足中藥生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制的需求。本研究以辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷、連翹苷作為指標成分，建立了小兒消積止咳提取過程中4 個成分的含量預(yù)測模型，兼顧了同一藥材不同性質(zhì)的成分及不同藥味的指標成分，能夠快速地、較全面地反映其提取過程中的質(zhì)量變化。

4 結(jié)論

本研究中建立的小兒消積止咳提取過程NIR 定量分析模型，預(yù)測性能良好、準確度高，可為監(jiān)測提取過程中多指標成分的動態(tài)變化、異常情況的判斷提供參考。