醋五味子配方顆粒及其原料藥材飲片中3個(gè)木脂素成分的含量測(cè)定△

劉子禎，姜蕊，楊浩

1.康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 深圳 518000；

2.保定市第一中心醫(yī)院 中藥藥劑科，河北 保定 071000；

3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；

4.湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，其味酸、甘，性溫，歸肺、心、腎經(jīng)，具有收斂固澀、補(bǔ)腎寧心之效，常被用于治療內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥[1-2]。五味子經(jīng)過(guò)醋蒸法炮制至黑色即得醋五味子[1]。醋五味子經(jīng)提取、濃縮、干燥即可制成供中醫(yī)臨床配方用的醋五味子配方顆粒[3]。五味子與醋五味子均被《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020年版收載，同時(shí)，《中國(guó)藥典》2020 年版要求兩者均對(duì)五味子醇甲進(jìn)行含量測(cè)定[1]。對(duì)于醋五味子配方顆粒，雖有少量文獻(xiàn)報(bào)道其原兒茶酸、綠原酸、五味子甲素及五味子乙素的含量測(cè)定研究，但鮮有報(bào)道其五味子醇甲的含量研究[3-4]。五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H 均是五味子中主要的木脂素類成分，具有降低肝炎患者血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用，同時(shí)可顯著抑制15-脂加氧酶（15-LOX）、環(huán)氧化酶-1（COX-1）和COX-2 活性[5-6]。目前，雖然國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布了《中藥配方顆粒品種試點(diǎn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)》160 個(gè)品種的標(biāo)準(zhǔn)公示稿，但醋五味子配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)依然處于空白狀態(tài)。

研究報(bào)道，醋蒸法炮制和配方顆粒的干燥溫度對(duì)中藥中成分會(huì)產(chǎn)生一定影響[7-9]。但有關(guān)醋五味子配方顆粒從原料藥材到飲片，再到配方顆粒各階段中成分含量的變化情況，目前鮮有研究報(bào)道。

因此，建立醋五味子配方顆粒含量測(cè)定方法，闡明其從原料藥材到配方顆粒各階段成分及含量的變化情況，對(duì)醋五味子配方顆粒質(zhì)量控制具有重要意義。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定醋五味子配方顆粒及原料藥材、飲片中五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H 的含量測(cè)定方法，同時(shí)對(duì)配方顆粒生產(chǎn)的各階段成分變化進(jìn)行分析，為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695 型alliance HPLC 儀，包 括G1311B 型四元泵、G1367E型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型二極管陣列檢測(cè)器（PDA）、G1330B 型柱溫箱、色譜工作站（Waters 公司）。Sartorius arium? Pro DI 型超純水系統(tǒng)、BP 211D 型十萬(wàn)分之一天平、ME36S 型百萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)賽多斯公司）；FW80 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品五味子醇甲（批號(hào)：110857-201815，純度：99.7%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品五味子醇乙（批號(hào)：ST05480120，純度≥98.0%）、當(dāng)歸酰基戈米辛H（批號(hào)：ST17510105，純度≥98.0%）均購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；乙腈、甲醇（色譜級(jí)，賽默飛世爾科技有限公司）；水為純化水。

19批五味子藥材（編號(hào)：Y1～Y19）均經(jīng)康美藥業(yè)股份有限公司質(zhì)量管理中心劉茂貴主任藥師鑒定為五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)。所有藥材均按《中國(guó)藥典》2020 年版炮制方法炮制成醋五味子飲片（編號(hào)：Z1～Z19），再將醋五味子提取、濃縮、干燥制成19 批醋五味子配方顆粒（編號(hào)：S1～S19），樣品信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

AgilentZORBAXSB-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm）；以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相梯度洗脫（0～25 min，45%～55%A）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；進(jìn)樣量為10μL。理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H，加甲醇制成五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H質(zhì)量濃度分別為15.2、7.8、4.6 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，冷藏，備用。另依次分別稱取上述3 個(gè)對(duì)照品55.44、18.96、9.78 mg，分別置于30 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

分別取五味子藥材、醋五味子飲片粉末（過(guò)三號(hào)篩）各約0.25 g（醋五味子配方顆粒研成細(xì)粉，精密稱取約0.5 g），分別置于錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（250 W，20 kHz）30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得五味子藥材、醋五味子飲片及醋五味子配方顆粒供試品溶液。另取糊精（配方顆粒中添加的輔料）0.25 g，同法制得陰性對(duì)照溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn)

將混合對(duì)照品溶液、藥材（Y1）供試品溶液、飲片（Z1）供試品溶液、配方顆粒（S1）供試品溶液、陰性對(duì)照溶液分別按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)照品、供試品溶液色譜圖的基線均平穩(wěn)且色譜峰分離度、對(duì)稱性良好，供試品色譜峰在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，說(shuō)明色譜方法專屬性良好。

圖1 混合對(duì)照品、醋五味子配方顆粒及其對(duì)應(yīng)的藥材與飲片及陰性對(duì)照樣品的HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察

取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，依次分別進(jìn)樣2、4、8、15、20、25μL，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：五味子醇甲Y=2.83×106X-3.93×106（r=0.999 8），線性范圍0.030～0.380 μg；五味子醇乙Y=2.03×106X-3.67×106，（r=0.999 8），線性范圍0.016～0.195 μg；當(dāng)歸酰基戈米辛HY=1.87×106X-4.92×105，（r=0.999 8），線性范圍0.009～0.115 μg，結(jié)果表明所測(cè)各成分在相應(yīng)的進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)針6 次，每次10 μL，計(jì)算得到五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H 峰面積的RSD分別為0.33%、0.66%、0.28%。表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取Y1、Z1、S1 樣品粉末，按2.3 項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各樣品中被測(cè)成分的含量。五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H 的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.67%、0.27%、0.09%，RSD 分別為0.46%、0.52%、0.72%（Y1）；0.73%、0.29%、0.11%，RSD 分 別 為0.72%、0.56%、0.63%（Z1）；0.22%、0.08%、0.04%，RSD 分 別 為0.84%、1.01%、1.97%（S1）。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取Y1、Z1、S1 樣品粉末，按2.3 項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H 峰面積的RSD 分別為0.94%、0.58%、1.12%（Y1）；1.52%、1.4%、0.77%（Z1）；0.99%、0.31%、0.20%（S1）。說(shuō)明各供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的五味子藥材粉末（Y1）0.25 g、醋五味子飲片粉末（Z1）0.25 g、醋五味子配方顆粒（研細(xì)，S1）0.5 g，各9份，精密稱定，分別精密加入2.2項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液適量（加入量為各樣品中待測(cè)成分已知含量的80%、100%、120%），自然揮干，按2.3項(xiàng)下方法處理，再按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率（表2～4）。

表2 五味子中3個(gè)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品含量測(cè)定

按2.3 項(xiàng)下方法制備五味子藥材（Y1～Y19）供試品溶液、醋五味子飲片（Z1～Z19）供試品溶液、醋五味子配方顆粒（S1～S19）供試品溶液，每個(gè)供試品平行3份，再按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各供試品中3個(gè)被測(cè)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表5～7。19批五味子藥材樣品中，五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.44%～0.88%、0.11%～0.44%、0.07%～0.14%。19 批醋五味子飲片樣品中，五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H 的 質(zhì) 量 分 數(shù) 分 別 為0.48%～0.91%、0.13%～0.47%、0.09%～0.15%。19 批醋五味子配方顆粒樣品中，五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.15%～0.36%、0.02%～0.16%、0.02%～0.06%。整體上，五味子藥材、醋五味子飲片、醋五味子配方顆粒中，五味子醇甲含量均最高，五味子醇乙次之，當(dāng)歸酰基戈米辛H最少。

表5 五味子藥材中3個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）

表3 醋五味子飲片中3個(gè)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定醋五味子配方顆粒及原料藥材、飲片中五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H 含量測(cè)定方法，該方法分析時(shí)間短、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，適用于醋五味子配方顆粒及原料藥材、飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

不同產(chǎn)地對(duì)比：來(lái)自道地產(chǎn)區(qū)黑龍江、吉林和遼寧的五味子藥材（Y11～Y15）中各成分含量相對(duì)穩(wěn)定[10]。來(lái)自河北省唐山市的五味子藥材Y18、Y19中3 個(gè)成分含量最高，而Y16、Y17 中含量則最低，說(shuō)明河北產(chǎn)的五味子藥材質(zhì)量不穩(wěn)定，可能與采收期、加工方式有關(guān)[11]。配方顆粒及其原料藥材、飲片之間對(duì)比：整體上，與五味子藥材相比，醋五味子飲片中3 個(gè)木脂素成分的含量均稍有提高，可能是由于這3 個(gè)成分化學(xué)結(jié)構(gòu)均含有羥基，而炮制輔料醋主要成分乙酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羧基，炮制過(guò)程中羥基與羧基產(chǎn)生氫鍵作用，促使3 個(gè)成分在乙酸環(huán)境下更容易溶出[12]。

表4 醋五味子配方顆粒中3個(gè)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

前期，醋五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備研究結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H 從藥材轉(zhuǎn)移至標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量轉(zhuǎn)移率僅約25%，說(shuō)明進(jìn)入患者體內(nèi)的成分量較少，大部分（約75%）殘留于煎煮后的藥渣中，這是五味子醇甲等木脂素類成分難溶于水的物理性質(zhì)所致。醋五味子配方顆粒，實(shí)際上是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行濃縮、干燥，再進(jìn)行制粒所得，因此，患者服用對(duì)應(yīng)的配方顆粒后所攝入的成分含量和標(biāo)準(zhǔn)湯劑是一致的。本研究中，每克醋五味子配方顆粒相當(dāng)于4 g飲片。

表6 醋五味子飲片中3個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）

表7 醋五味子配方顆粒中3個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）

本研究還做了以下探究：1）供試品的制備方法考察。對(duì)不同溶劑包括水、70%乙醇、稀乙醇、甲醇、50%甲醇進(jìn)行比較，結(jié)果以甲醇超聲提取30 min所提出的成分含量最高，故采用甲醇作為提取溶劑。2）流動(dòng)相系統(tǒng)的對(duì)比。與甲醇-水系統(tǒng)相比，乙腈-水系統(tǒng)下的色譜峰保留時(shí)間更小、系統(tǒng)壓力更小，因此流動(dòng)相采用乙腈-水。3）檢測(cè)波長(zhǎng)的確定。對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)（200～400 nm）掃描，當(dāng)波長(zhǎng)為220 nm時(shí)，各待測(cè)成分色譜峰峰高最高，故波長(zhǎng)定為220 nm。4）色譜柱的對(duì)比。因Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱的分離效果較Thermo Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）略好，故選用Agilent 色譜柱。5）不同流速及柱溫對(duì)各待測(cè)成分色譜峰分離效果的影響考察，結(jié)果表明柱溫為30 ℃、流速為1.0 mL·min-1時(shí)樣品的分離效果較好。