miR-149-5p過表達對重癥肺炎大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR通路的影響研究

蔣渝 張亮宇 黃薇

重癥肺炎在臨床上是常見的疾病之一，是指肺部的炎癥情況比較嚴重，可引起全身炎性反應，如果肺炎患者出現嚴重的低氧血癥或急性呼吸衰竭則需要通氣支持；或出現低血壓、休克等循環(huán)衰竭表現和其他器官功能障礙可認定為重癥肺炎[1,2]。常見的病因是在伴有心肺基礎或附加危險因素上感染肺炎，特殊病原微生物(SARS病毒、禽流感病毒、軍團菌等)感染，會增加肺炎的嚴重程度和死亡風險；臨床主要表現有嗜睡、煩躁、呼吸衰竭、精神萎靡、血壓下降等，重者會出現昏迷、驚厥、意識障礙、視盤水腫，進而出現腦疝[3]。臨床常用的治療手段為藥物治療，其中主要環(huán)節(jié)為抗感染治療，抗生素和給藥途徑則需參考患者的年齡、吸入史、有無基礎疾病、肺炎的嚴重程度等[4]。重癥肺炎的原則在于重視病原學診斷和早采集呼吸道標本，查找病原體的方式有采用血培養(yǎng)、血清檢測等途徑[5]。在本研究中，主要分析miR-149-5p過表達對重癥肺炎大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選取45只清潔級、SPF級小鼠，雄雌各半，由希百壽藥業(yè)有限公司提供[動物許可證號：SYXK(豫)2020-0001]，鼠齡3～6個月，平均鼠齡(4.5±0.75)個月；體重214～258 g，平均體重(236±11)g；小鼠均在無病原菌的干凈籠子里喂養(yǎng)，所飲用的水和食物都要進行過高溫以及高壓的消毒，飼養(yǎng)溫度維持在23℃。本實驗經我院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 養(yǎng)血瓊脂糖平板(北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司)；肺炎克雷伯菌(上海北諾生物科技有限公司)；酶聯免疫試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)；恒溫孵育箱(香港友誠生物科技有限公司)；胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 建模:隨機選取45只大鼠中15只作為對照組，其余大鼠參照吳萍等[6]研究實驗中重癥肺炎模型建立方法建立重癥肺炎大鼠模型，模型構建前1 d，在養(yǎng)血瓊脂糖平板上接種肺炎克雷伯菌并放置在37℃恒溫培養(yǎng)，次日將菌落收集后并用無菌0.9%氯化鈉溶液將其稀釋呈1.2×1014CFU/L的混懸液。在大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉溶液用于麻醉，頸部備皮消毒，在無菌環(huán)境下切開頸部皮膚使上段氣管暴露，選用24G的Y型靜脈留置針經氣管插管，將菌液從留置針白色帽端處注入大鼠體內。將完全稀釋好的肺炎克雷伯菌混合液，對過表達組、沉默組大鼠進行緩慢灌注，每只0.3 ml；為降低大鼠肺部刺激，每注射0.05 ml固定豎立左右轉動45 s，對照組大鼠灌注等體積0.9%氯化鈉溶液。末次灌注結束后讓大鼠保持豎立和倒立各2 min，讓菌液均勻分布雙肺各肺葉，然后緩慢抽出靜脈留置針，將傷口縫合并進行局部消毒。

1.3.2 肺組織病理組織學觀察評價:選取適當體積的肺組織，經多聚甲醛固定后或石蠟保存，做成組織切片，HE染色后中性樹膠，蓋玻片封固，顯微鏡下觀察大鼠肺組織上皮細胞。

1.3.3 細胞培養(yǎng)與轉染:將大鼠肺組織細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，將其放置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，取生長情況良好的對數生長期細胞，接種于6孔細胞板，待細胞融合度達到70%～80%時，可進行后續(xù)轉染實驗。取對數生長期細胞進行實驗并根據實驗設計分為對照組、上調組和下調組，其中對照組細胞不做任何處理，而對上調組、下調組按照吉凱基因《慢病毒載體使用操作手冊》分別進行脂質體轉LV-control和LV-miR-145-5p。

1.3.4 3組大鼠肺組織凋亡蛋白表達量評價:采用免疫組織化學法檢測Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9水平，實驗步驟如下：使用PBS代替一抗作為陰性對照組，染色結果采取半定量分析，高倍鏡下(×400)每張切片隨機選取5個視野，采用同濟HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)檢測吸光度值，計算平均值。

1.3.5 3組大鼠肺組織中炎性因子水平評價:采用酶聯免疫法檢測大鼠炎性因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10水平，實驗步驟：將血清樣本置于室溫后，取出試劑盒，標記酶標板，制作標準品，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應孔上依次加入稀釋好的待測血清及標準品100 μl/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用專用洗滌液將反應板清洗3次后，加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100 μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應板4次后，在反應孔內加入TMB溶液100 μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應孔內加入終止液100 μl/孔以終止反應，在450 nm波長(參考波長570～630 nm)測定吸光度，顏色反應深淺與IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10水平成正比，經繪制標準曲線計算IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10水平。

1.3.6 3組大鼠肺組織GSH、ROS及T-AOC含量評價:采用MTT比色法檢測GSH、ROS及T-AOC含量，實驗步驟：用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，細胞按7×103個/孔接種于96孔板，每孔體積200 μl，培養(yǎng)2～4 d后，每孔加入MTT繼續(xù)孵育4 h后停止，棄上清液，懸浮細胞上的培養(yǎng)清液離心后再吸棄，每孔加入150 μl DMSO，振蕩12 min，選擇570 nm波長，采用酶聯免疫檢測儀測定各孔光吸收值。

1.3.7 3組大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR通路因子表達量評價:采用實時熒光定量PCR測定3組細胞中PI3K/Akt/mTOR通路因子表達量,cDNA合成反轉錄體積20 μl，其中4 μl 總RNA，1 μl(0.5 μg)隨機引物、0.5 μl(20 U)RNase、2 μl 10 mMdNTP、0.8 μl(15 U)M-mlV反轉錄10×RT緩沖液3 μl，加滅菌DDW至20 μl，42℃水浴1 h，95℃ 5 min滅活M-mlV逆轉錄，-30℃凍存?zhèn)溆?。PCR反應體系：PCR反應體積20 μl,其中2 μl 10×Buffer，2 μl MgCl2，2 μl dNTP，2 μl cDNA，2 μl引物，2.5U Taq DNA多聚酶，滅菌DDW加至20 μl。PCR反應條件：經95℃預變性10 min；95℃，15 s；60℃，30 s；循環(huán)40次。采用2-△△Ct方法計算出細胞中PI3K/Akt/mTOR通路因子Bax、Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達量。見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 肺組織病理組織學觀察 對照組大鼠肺組織上皮完整，無損傷現象；沉默組大鼠肺組織明顯存在炎性因子浸潤現象，平滑肌面積及厚度增加，還存在氣道上皮組織壞死、脫落，支氣管及其周邊組織結構混亂，可見其肺損傷程度極其嚴重；過表達組大鼠肺組織狀態(tài)較沉默組有顯著改善，支氣管及其周邊組織趨于規(guī)整，且炎性細胞浸潤的程度降低，平滑肌面積及厚度增厚現象有所改善。見圖1。

2.2 3組大鼠肺組織凋亡蛋白表達量比較 過表達組、沉默組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達量均高于對照組，過表達組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達量低于沉默組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 3組大鼠肺組織中炎性因子水平比較 過表達組、沉默組大鼠肺組織中炎性因子水平高于對照組(P<0.05)；過表達組大鼠肺組織中炎性因子水平低于沉默組(P<0.05)。見表3。

表2 3組大鼠肺組織凋亡蛋白表達量比較

表3 3組大鼠肺組織中炎性因子水平比較

2.4 3組大鼠肺組織GSH、ROS及T-AOC含量比較 過表達組、沉默組GSH、ROS高于對照組，T-AOC含量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；過表達組GSH、ROS低于沉默組，T-AOC含量高于沉默組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

2.5 3組大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR通路因子表達量比較 過表達組Bax mRNA表達量高于對照組，Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達量低于對照組，沉默組Bax mRNA表達量低于對照組，Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；過表達組Bax mRNA表達量高于沉默組，Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達量低于沉默組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表4 3組大鼠肺組織GSH、ROS及T-AOC含量比較

表5 3組大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR通路因子表達量比較

3 討論

重癥肺炎是肺部感染性疾病之一，可引起機體多器官功能障礙，根據其獲得環(huán)境不同分為重癥社區(qū)獲得性肺炎和重癥醫(yī)院獲得性肺炎，兩種類型重癥肺炎均具有較高的患病率和死亡率[7,8]。目前對于重癥肺炎包括依賴抗菌藥物、機械通氣、液體支持和血液凈化等多手段，占用大量的醫(yī)療資源，但其病死率仍然較高，故找到其發(fā)病機制，對疾病轉歸、獲得早期有效治療及改善預后都具有較為重要的意義價值[9]。miRNA是一類內源性、序列高保守的單鏈非編碼小RNA，對基因表達具有調控作用[10]。有研究證實miR-149-5p在結腸癌、口腔鱗狀癌、肝癌、乳腺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，其表達水平具有特異性[11]。在劉杰等[12]的研究中，miR-149-5p在結腸癌細胞中呈過表達，可抑制結腸癌細胞的增殖，并誘導其凋亡，但在本文研究中過表達miR-149-5p可抑制細胞凋亡，減輕肺組織細胞的損傷程度，也證實miR-149-5p表達具有特異性。

Caspase是一組存在于細胞質中具有類似結構的蛋白酶與真核細胞凋亡有密切關聯，在細胞的生長、分化與凋亡等過程中起調節(jié)作用[13]。Caspase-3在細胞凋亡中起著不可替代的作用，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細胞殺傷機制的重要組成部分[14]。在曹麗萍等[15]的研究中，抑制Caspase-3蛋白的表達，可減少細胞凋亡，緩解大鼠肺組織損傷程度，與本文研究結果一致。Caspase-8在死亡受體介導的細胞凋亡過程中扮演著重要的角色，是死亡受體介導的凋亡途徑中的重要分子，可通過寡聚而自身切割活化，可激活Caspase，產生凋亡效應。Caspase-9與Caspase-8具有相似和不同影響了在Caspase家族起催化作用部位的聚合-裂解，能被用作具有高度選擇和合理性的Caspase抑制劑的活性區(qū)域具有差異性[16,17]。在本文研究中，過表達組大鼠Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達量低于沉默組，說明過表達miR-149-5p，可有效抑制Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達量，進而抑制細胞凋亡，減輕肺組織的損傷程度。

PI3K/Akt/mTOR通路是經典信號通路之一，主要通路因子有Bax、Bcl-2、BDNF、pERK、VGF等[18]。Bax和Bcl-2是Bcl-2基因家族中細胞凋亡的促進基因，若Bax水平升高可拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞趨于死亡；Bcl-2是一種癌基因，具有明顯的抑制細胞凋亡的作用，若Bcl-2過表達能增強所觀察細胞對大多數細胞毒素的抵抗性[19,20]。在劉月英等[21]的研究中，下調Bax、上調Bcl-2蛋白水平可降低細胞凋亡，與本文研究結果一致。pERK是位于內質網膜上的一種Ⅰ型跨膜蛋白，屬于elF2a上游激酶家族中的一種；pERK信號通路的激活發(fā)生在內質網應激早期，pERK通過誘導CHOP的表達而促進細胞凋亡。在本文研究中，過表達組Bax mRNA表達量高于沉默組，Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達量低于沉默組，說明過表達miR-149-5p，可通過作用于PI3K/Akt/mTOR通路，調控Bax、Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達量，進而抑制細胞凋亡，減輕機體炎性反應和肺組織損傷。

綜上所述，過表達miR-149-5p，可通過作用于PI3K/Akt/mTOR通路，調控Bax、Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達量，減輕炎性反應，抑制細胞凋亡。但因本研究所采用的樣本數量有限和研究時間較短，為證實和對比miR-149-5p過表達對重癥肺炎大鼠肺組織PI3KAktmTOR通路的影響，還需進一步開展大樣本試驗證實。