蚯蚓原位堆肥提升番茄連作土壤質(zhì)量研究

曹云娥，尹 翠，吳澤帥，張美君，李建設(shè)*，田永強,3*

（1 寧夏大學農(nóng)學院，銀川 750021；2 寧夏共享人力集團有限公司，銀川 750021；3 中國農(nóng)業(yè)大學園藝學院，北京 100193）

連作障礙是長期困擾國內(nèi)外農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的復雜問題之一，尋求克服或緩解連作障礙措施已迫在眉睫。目前生產(chǎn)上解決連作障礙的對策主要包括輪作換茬、間作套種、土壤消毒、抗性品種栽培和生物防治等方法[1]。近年來，大量研究表明，添加土壤改良劑可以緩解連作障礙的發(fā)生，其中以有機物料和蚯蚓糞的效果較為明顯[2]。由于在改善土壤物理、化學和生物學性質(zhì)等方面的優(yōu)勢以及較強的實際可操作性，蚯蚓糞目前已被成功應(yīng)用于作物連作障礙防治。有研究表明，在連作土壤上添加蚓糞，可顯著增加土壤中細菌和放線菌數(shù)量，降低真菌豐度尤其是尖孢鐮刀菌的種群數(shù)量，提高土壤酶活性和養(yǎng)分含量，促進植株根系健康生長，提高作物的生物量，進而緩解作物連作障礙[3–4]。

番茄 (Lycopersicon esculentum Mill.) 是設(shè)施栽培中種植最廣泛的蔬菜作物之一[5]。因其口感適宜，營養(yǎng)價值高，備受消費者喜愛，市場需求量大，經(jīng)濟效益較高，番茄總產(chǎn)量在我國設(shè)施農(nóng)業(yè)中位居首位[6]。為追求高產(chǎn)量和高效益，加之規(guī)?；图s化種植，菜田復種指數(shù)越來越高，導致菜田土壤微生物種群結(jié)構(gòu)失衡、有害微生物種群密度上升、質(zhì)量下降、理化性狀惡化、養(yǎng)分缺失、農(nóng)藥殘留、病蟲害加重等一系列連作障礙問題[7–8]。這不僅造成蔬菜大幅減產(chǎn)，而且使得產(chǎn)品品質(zhì)下降，不利于蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[9–10]。連作障礙已成為制約我國番茄可持續(xù)生產(chǎn)的主要瓶頸問題之一[11]。

蚯蚓堆肥(vermicompost)是近幾年興起的普適性較好的土壤改良劑，其在克服連作障礙方面的效果顯著[12]。蚯蚓堆肥的施用可以減少養(yǎng)分流失，增加土壤肥力，提高碳封存力，保持土壤碳平衡，調(diào)節(jié)土壤pH等[12–13]。此外，蚯蚓堆肥可通過改變土壤的pH和微量營養(yǎng)元素的可利用性來改善微生物的活性和結(jié)構(gòu)，促進土壤有益微生物的增加[14–15]。例如，蚯蚓堆肥的施用可以明顯促進微生物介導的有機質(zhì)循環(huán)，提升土壤細菌群落多樣性和微生物碳源利用水平，進而改善土壤整體質(zhì)量。此外，蚯蚓堆肥的施用可以提高植株的抗性。如有研究表明，施加蚯蚓堆肥會顯著提升土壤質(zhì)量(維持酸堿平衡、增加微生物活性)，并增加植株根系累積的防御物質(zhì)，從而使感病植株表現(xiàn)出較強的根結(jié)線蟲抗性[16]。蚯蚓堆肥的上述優(yōu)良性狀使得其在蔬菜栽培上的應(yīng)用前景廣闊。

目前, 已有的研究多集中在利用蚯蚓異位處理有機廢棄物料形成的蚯蚓糞(蚯蚓異位堆肥)對土壤質(zhì)量的提升和連作障礙的克服效果，而對利用蚯蚓原位堆肥(在田間栽培畦原位同時投入有機廢棄物料和蚯蚓)克服土壤連作障礙的研究報道較少。為此，本研究從土壤微生態(tài)角度出發(fā)，探討蚯蚓原位堆肥對連作5年設(shè)施番茄土壤細菌群落結(jié)構(gòu)、土壤理化性質(zhì)的影響，為蚯蚓生物治理番茄連作障礙提供理論支撐，并為設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供支持。重點研究細菌群落是因為細菌在設(shè)施番茄土壤中占主導作用，是調(diào)控土壤質(zhì)量體系的關(guān)鍵[17–18]。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2017年8月6日至2019年1月10日在寧夏銀川賀蘭山園藝科技示范區(qū) (106.3°E, 38.6°N)光伏溫室內(nèi)進行。供試土壤為連作5年(2012—2016)番茄的沙壤土，2017年土壤的理化性質(zhì)：全氮0.15 g/kg、全磷 0.12 g/kg、速效氮 13.8 mg/kg、速效磷11.2 mg/kg、速效鉀 524 mg/kg、pH 7.76、電導率(EC) =0.89 mS/cm)；供試番茄品種為‘粉宴 1號’，起壟種植，株距為30.0 cm，每壟布置兩條滴灌管，滴頭間距 0.30 m。

試驗采用單因素隨機區(qū)組設(shè)計，共設(shè)置3個處理：施用化肥對照(CK)；蚯蚓異位堆肥(T1；將蚯蚓消解牛糞制備蚯蚓糞均勻撒施在栽培壟上)；蚯蚓原位堆肥(T2；將牛糞均勻撒施在栽培壟上，放入蚯蚓消解牛糞)。每個處理設(shè)置3個重復，隨機排列。小區(qū)面積為31.5 m2，每個小區(qū)種植3壟，每壟長7.50 m，寬 0.70 m，壟間距 0.70 m。3個處理的氮素投入量相同，兩個蚯蚓糞處理包含同樣的牛糞和蚯蚓量。CK處理基施尿素0.69 t/hm2；T1處理基施蚯蚓糞 130.4 t/hm2，T2處理直接施入牛糞 179.4 t/hm2、蚯蚓 1.67 t/hm2。蚯蚓糞全氮含量 2.38 g/kg，牛糞全氮含量為1.73 g/kg。供試蚯蚓為赤子愛勝蚓(Eisenia foetida)。在苗期、開花期和坐果期分別隨水施入配方水溶肥(尿素183.00 mg/L，磷酸二氫銨77.05 mg/L，硝酸鉀 202.00 mg/L，硫酸鉀 174.00 mg/L)。每茬拉秧結(jié)束后，重復施用上述尿素、蚯蚓糞、牛糞，蚯蚓不再增加(蚯蚓可自身繁殖)。

1.2 樣品采集

在每茬番茄盛果期采集根際土壤。每個處理隨機選擇5株，將番茄連根拔起后，把根際土抖落到報紙上，去除石子、根系等雜物，混勻后過篩。將每個處理樣品分成兩份，一份裝入離心管中，迅速放入液氮中保存，用于土壤微生物基因組 DNA 提?。涣硪环葑匀伙L干，用于土壤理化性質(zhì)和酶活性測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA 提取、PCR 擴增和 Illumina Miseq 測序

根據(jù) Power Soil DNA 試劑盒 (MoBio Laboratories Inc.，CA, USA)說明書對土壤總 DNA 進行提取，DNA濃度和純度利用Nano Drop 2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量；用338F(5'–ACTCCTACGGGAGGCAGCAG–3')和 806R(5'–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3')引物對細菌DNA的 16 SrRNA V3–V4區(qū)段進行 PCR擴增，然后在Illumina MiSeq平臺上進行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物純化并測序。在97%的序列相似度水平上，將質(zhì)量過濾后的序列進行分類單元(operational taxonomic units, OTUs)的分類。用QIIME進行稀疏分析[19]，以區(qū)分OTU豐富度、Shannon豐富度和總物種豐富度的Chao1水平[20]、Coverage指數(shù)和Simpson指數(shù)[21]。為了預(yù)測微生物群落的代謝功能，使用PICRUSt從16S rRNA 數(shù)據(jù)生成功能圖譜[22]。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)測定土壤理化性質(zhì)測定方法參照《土壤農(nóng)化分析》[23]進行。在土水質(zhì)量比為1∶10時測定樣品pH和EC值；用凱氏定氮法測定全氮含量；用堿解擴散法測定堿解氮含量；用重鉻酸鉀-硫酸氧化法測定土壤有機質(zhì)含量；用NaHCO3(0.5 mol/L)浸提—鉬銻抗比色法測定速效磷含量；采用高氯酸–硫酸法測定土壤全磷；采用氫氟酸–高氯酸法測定土壤全鉀；用 NH4OAc (1 mol/L) 浸提—火焰光度法測定速效鉀含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理和相關(guān)圖表制作，采用SPSS 20.0軟件進行顯著性(P<0.05)和Pearson相關(guān)性分析。采用單因素分析(one-way ANOVA)，當數(shù)據(jù)間達到顯著性差異(P<0.05)時，采用Tukey’s HSD 進行方差分析。利用北京奧維森基因科技有限公司的測序平臺(https://cloud.allwegene.com) 進行 α 多樣性分析。使用 CANOCO 5.0軟件分析土壤細菌門水平群落結(jié)構(gòu)、細菌相對豐度。對于高通量原始測序數(shù)據(jù)，去除接頭序列后，根據(jù)overlap將雙端測序序列拼接成單條序列，并對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾。參考已知數(shù)據(jù)庫GreenGenes去除嵌合體序列，得到最終可用的序列，并將質(zhì)量過濾后的序列在97%的序列相似度水平上進行分類單元(OTUs)的分類。由于微生物的群落功能組成與環(huán)境的關(guān)系比物種組成更為密切，因此基于16 SrRNA的測序結(jié)果，采用PICRUSt進行了功能預(yù)測。為了準確預(yù)測功能構(gòu)成，首先對原始測序數(shù)據(jù)的種屬數(shù)量進行標準化處理，然后將其映射在構(gòu)建好的已測序基因組的種屬功能基因構(gòu)成表上，獲得生化代謝途徑和三級KEGG預(yù)測的功能結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蚯蚓堆肥處理對連作土壤理化性質(zhì)的影響

由圖1可知，連續(xù)3茬蚯蚓異位堆肥(T1)和原位堆肥(T2)處理下土壤EC和pH均顯著降低，且前兩茬T2處理EC顯著低于T1，第三茬T2和T1處理間無顯著差異；土壤全氮、全磷、全鉀、總碳、有效氮和速效鉀含量三茬基本表現(xiàn)為T2>T1>CK(P<0.05)的趨勢。這說明，相較于蚯蚓異位堆肥，蚯蚓原位堆肥更有利于提升土壤肥力水平。而且，由于原位堆肥無需每次加入蚯蚓，其堆肥的制作(無需占地和二次運輸)和使用成本也大大降低。

圖1 不同處理下土壤理化性質(zhì)Fig. 1 Physiochemical properties of soils under different treatments

2.2 不同蚯蚓堆肥處理對連作土壤細菌群落數(shù)量、多樣性及豐富度的影響

由表1可知，3個茬口各處理的Coverage指數(shù)均在0.9233～0.9567，表明微生物數(shù)量分析的可靠性均很高。從多樣性指數(shù)看，CK處理的OTUs數(shù)量顯著低于T2和T1處理，平均下降了17.41%。OTUs數(shù)量、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)T1處理在第一茬與CK沒有顯著差異，從第二茬起顯著高于CK，而T2處理從第一茬起即顯著高于CK，且在第三茬顯著高于T1 (P<0.05)。Simpson指數(shù)反映的是物種的優(yōu)勢度，3個處理的Simpson指數(shù)無顯著性差異。說明蚯蚓堆肥處理主要顯著增加了土壤細菌群落的多樣性，但沒有改變細菌的構(gòu)成，且原位堆肥提高細菌多樣性的效果顯著好于異位堆肥。

表1 土壤細菌群落多樣性和豐富度指數(shù)Table 1 Soil bacterial community diversity and richness index

2.3 不同蚯蚓堆肥處理對連作土壤細菌群落組成的影響

在門水平上，共獲得48個相對豐度>0.5%的菌群(圖2)。其中，平均相對豐度>2%的菌群在3個處理土壤中的相對豐度為：變形菌門 (Proteobacteria)29.00%～59.06%、放線菌門 (Actinobacteria) 13.63%～34.65%、厚壁菌門(Firmicutes) 3.92%～13.80%、綠彎菌門 (Chloroflexi) 5.64%～13.34%、酸桿菌門(Acidobacteria)2.00%～10.00%、擬桿菌門(Bacteroidetes) 1.79%～16.02%、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes) 2.00%～4.32%、硝化螺旋菌門(Nitrospirae) 0.52%～3.21%，占到全部菌門的 92.71%～97.44%。平均相對豐度均< 2%的其他7類菌群僅占整個菌門的2.56%～7.29%。蚯蚓處理土壤相對豐度較高的菌群隨種植茬數(shù)的延長有變化，在第1茬相對豐度最高的優(yōu)勢菌門是變形菌門，第2茬是厚壁菌門和芽單胞菌門，第3茬則是變形菌門綠彎菌門和異常球菌–棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)。

連續(xù)3茬施肥處理后，相較于CK，T1和T2處理的變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門和硝化螺旋菌門均顯著增加，而與連作障礙相關(guān)的酸桿菌門和擬桿菌門顯著降低。這說明，蚯蚓異位堆肥(T1)和蚯蚓原位堆肥(T2)處理均能夠抑制這些菌在土壤中的相對豐度。此外，相較于CK和T1，T2處理顯著增加了綠彎菌門、芽單胞菌門的相對豐度，說明這兩類菌可能是蚯蚓原位堆肥(T2)處理抑制連作障礙相關(guān)菌的特殊菌門。

在屬水平上，相對豐度大于0.5%的菌屬如圖2所示。變形菌門中的假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、亞硝酸菌屬(Nitrosomonas)，厚壁菌門的芽孢桿菌屬(Bacillus)，放線菌門的鏈霉菌屬(Streptomyces)，污物假節(jié)桿菌屬(Pseudarthrobacter)和硝化螺旋菌門的硝化螺旋菌屬(Nitrospira)平均相對豐度均大于1%，為優(yōu)勢菌屬。與CK相比，T1和T2處理的假單胞菌屬、鏈霉菌屬、硝化螺旋菌屬和污物假節(jié)桿菌屬的相對豐度無顯著差異，而鞘氨醇單胞菌屬、亞硝酸菌屬和芽孢桿菌屬的相對豐度顯著增加。這說明，鞘氨醇單胞菌屬、亞硝酸菌屬和芽孢桿菌屬可能是蚯蚓異位堆肥(T1)和蚯蚓原位堆肥(T2)處理抑制連作障礙的優(yōu)勢菌屬。

圖2 不同處理土壤優(yōu)勢細菌門和屬的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of dominant soil bacteria at the phylum and genus levels under different treatments

2.4 不同蚯蚓堆肥處理對連作土壤代謝功能的影響

微生物群落的變化直接或間接地改變了代謝通路。為更直觀了解此種趨勢，本部分基于KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫的代謝功能各個處理間存在顯著性差異。由圖3可知，關(guān)于代謝途徑序列的相對豐度解釋了81.16%。在相對豐度大于5%的代謝通路中，第2茬蚯蚓改良處理下碳水化合物代謝、輔酶與維生素代謝、萜類和聚酮類化合物的代謝和其他氨基酸的代謝途徑的相對豐度顯著高于CK處理。第3茬蚯蚓改良處理下碳水化合物代謝、氨基酸代謝的相對豐度顯著高于CK處理。

圖3 不同處理土壤細菌群落生化代謝途徑Fig. 3 Biochemical metabolic pathways of soil bacterial community as affected by treatments

圖4列出了相對豐度排名前20的3級KEGG同源功能預(yù)測。3級KEGG同源功能預(yù)測結(jié)果顯示，在排名前20的代謝途徑中，3茬蚯蚓改良處理下D-精氨酸與 D-鳥氨酸代謝、C5-Branched dibasic acid metabolism 和 Cell cycle - Caulobacter的相對豐度顯著高于CK處理，蚯蚓處理(T2)的C5-Branched dibasic acid metabolism、Sulfur relay system 和 Cell cycle-Caulobacter顯著高于其他處理。說明C5-Branched dibasic acid metabolism 代謝途徑在改良連作土壤過程中具有重要作用。C5-Branched dibasic acid metabolism屬于二級代謝途徑中碳水化合物代謝途徑。再次驗證了碳水化合物代謝途徑在蚯蚓(糞)改良連作土壤中有重要作用。

圖4 不同處理土壤細菌群落3級KEGG同源功能的預(yù)測Fig. 4 The level 3 KEGG homologous function predictions of soil bacterial community as affected by treatments

2.5 土壤環(huán)境因子對門分類水平的細菌群落結(jié)構(gòu)或代謝功能的影響

采用RDA分析了土壤環(huán)境因子對門分類水平的細菌群落結(jié)構(gòu)或代謝功能的影響(圖5a)。由圖5a可知，第一排序軸和第二排序軸分別解釋了細菌菌落變化的59.94%和22.78% (合計82.72%)。經(jīng)過蒙特卡羅檢驗，TC (F=5.0，P=0.014)、EC (F=4.1，P=0.028)、TK (F=4.7，P=0.012)、AN (F=4.5，P=0.024)、TP (F=6.6，P=0.008)是解釋菌落差異的關(guān)鍵性因素。再次證實了蚯蚓能夠加速有機物質(zhì)的降解，提高土壤的總碳含量，進而影響細菌群落結(jié)構(gòu)。由相關(guān)性熱圖分析可知(圖5b)，EC、AN、TN、TP、AP、AK、TC和TN與門分類水平的細菌群落結(jié)構(gòu)有顯著或極顯著正負相關(guān)關(guān)系。EC與Actinobacteria呈顯著正相關(guān)關(guān)系；AN和Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Chlamydiae呈顯著負相關(guān)關(guān)系，與Peregrinibacteria呈極顯著負相關(guān)關(guān)系；TP與Armatimonadetes、WS6、Gracilibacteria和 Hydrogenedentes呈顯著性正相關(guān)關(guān)系；TC與Chloroflex、Tectomicrobia、Armatimonadetes和 Gracilibacteria呈顯著正相關(guān)關(guān)系；Chloroflexi與AK、TC和TN呈顯著負相關(guān)關(guān)系。在平均相對豐度大于1%的菌門中，EC、AN、TN、TP、AP、AK、TC和 TN與Actinobacteria和Chloroflexi呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明土壤特性會顯著影響Actinobacteria和Chloroflexi菌門。這與前面蚯蚓處理對連作土壤細菌群落組成的影響結(jié)果一致，Actinobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Deinococcus-Thermus、Chloroflexi和Nitrospirae在蚯蚓改良過程中起到了重要的作用。

為進一步分析不同土壤環(huán)境因子對KEGG代謝功能的影響，對土壤環(huán)境因子與KEGG代謝功能進行RDA分析。由圖5a可知，第一排序軸和第二排序軸分別解釋了代謝功能的66.83%和25.94% (合計92.77%)。經(jīng)過蒙特卡羅檢驗，EC (F=4.1，P=0.028)、TP (F=6.3，P=0.006)、TK (F=3.6，P=0.034)、AP (F=5.6，P=0.004)、AN (F=4.4，

圖5 微生物群落、功能與土壤理化性質(zhì)的RDA冗余分析(a)及相互關(guān)系熱圖(b)Fig. 5 RDA plots (a) and heatmap visualizing relationships (b) between microbial communities, metabolic functions and physiochemical properties

P=0.028)是解釋代謝功能的關(guān)鍵性因素。由相關(guān)性熱圖(圖4b)分析可知，EC、pH、TN、TP、AP、TK、TC和TN與代謝功能有顯著或極顯著正負相關(guān)關(guān)系。EC與細胞生長與死亡、大分子化合物折疊、降解和氨基酸代謝呈極顯著負相關(guān)關(guān)系，與遺傳物質(zhì)翻譯、復制與修復呈顯著負相關(guān)關(guān)系；與物質(zhì)轉(zhuǎn)運與分解代謝和類脂化合物代謝呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與氨基酸代謝呈顯著正相關(guān)關(guān)系。氨基酸代謝與EC和pH呈極顯著負相關(guān)關(guān)系；與TN呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；與TP、TK和TC呈顯著正相關(guān)關(guān)系。說明EC是影響KEGG代謝功能的關(guān)鍵土壤因子。

2.6 土壤細菌群落多樣性與土壤肥力指標的Person相關(guān)性分析

由土壤細菌群落多樣性與土壤肥力指標的Person相關(guān)性分析(表2)表明，除有效磷與Simpson指數(shù)沒有相關(guān)性外，TN、AN、TP、TK、AK和TC均有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)正相關(guān)關(guān)系(表2)，表明蚯蚓活動和蚯蚓糞可能通過增加土壤微生物多樣性進而提升土壤養(yǎng)分含量。因為在土壤養(yǎng)分循環(huán)過程中，土壤細菌占有十分重要的地位，因此當土壤細菌的數(shù)量降低時會引起土壤微生物功能的失調(diào)，從而降低土壤養(yǎng)分。

表2 土壤細菌群落多樣性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性Table 2 Correlation between microbial diversity indices and fertility of soils

3 討論

3.1 蚯蚓堆肥可提高連作土壤的微生物多樣性，抑制病原菌的數(shù)量

隨著集約化生產(chǎn)的進一步發(fā)展，復種指數(shù)高和茬口單一等原因，設(shè)施大棚土壤連作障礙問題日益突出。連作常會導致土壤板結(jié)和次生鹽漬化、作物生理病害加重、植株生長發(fā)育異常、果實品質(zhì)變劣和產(chǎn)量下降等[24]。連作障礙已成為制約我國一些地區(qū)種植業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問題。蚯蚓作為＂生態(tài)系統(tǒng)工程師＂，通過取食、消化、排泄(蚯蚓糞)、分泌(粘液)和掘穴等活動方式(蚯蚓處理)促進植物殘枝落葉的降解及有機物質(zhì)的分解和礦化，進而改善土壤結(jié)構(gòu)，增加土壤養(yǎng)分的可利用性，調(diào)控土壤微生物群落，提高土壤中有益微生物的種群數(shù)量和土壤肥力[25–26]。蚯蚓糞處理廢棄物形成蚯蚓糞，是一種將植物營養(yǎng)、生物活性激素和植物保護融為一體的優(yōu)質(zhì)高效有機肥料和土壤改良劑，蚯蚓糞內(nèi)含有大量的有益微生物，具有促進根系生長的作用[27]。連作土壤有其不同于其他耕作地的特點，例如連作草莓會發(fā)生尖孢鐮刀菌引起的枯萎病[32]。蚯蚓糞改良連作土壤的研究報道已有很多，目前已成功應(yīng)用于連作障礙防治，并取得了一定的研究成果。比如施用蚯蚓糞提高韭菜基質(zhì)中細菌和真菌的多樣性，增加養(yǎng)分有效性[28]，添加蚓糞或滅菌蚓糞顯著增加了連作土壤中的細菌和放線菌數(shù)量，降低了真菌特別是尖孢鐮刀菌數(shù)量，進而減輕蘋果連作障礙帶來的危害[4]。蚓糞處理番茄連作土壤顯著降低了優(yōu)勢真菌的相對豐度，從而緩解了番茄連作障礙[3]。施用蚯蚓糞較牛糞能減輕連作障礙中的酸化感效應(yīng)，促進脲酶等土壤相關(guān)酶活性提高，是緩解連作障礙及連作土壤滅菌對草莓植株生長發(fā)育影響的有效措施[2]。

在草莓連作土壤滅菌后施用具有生物活性的蚯蚓糞，可以促進根系生長，緩解土壤滅菌對草莓植株生長發(fā)育的影響，是值得推薦的有效措施[29]。通過溫室盆栽試驗，研究了在不同番茄種植歷史的土壤中，全生育期用有機肥代替礦質(zhì)肥對土壤肥力、番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，蚯蚓糞可作為改善連作番茄果實質(zhì)量、產(chǎn)量和土壤質(zhì)量的肥料[30]。利用溫室盆栽試驗研究0、5、和20年種植番茄，蚯蚓糞對土壤微生物特性、酶活性和番茄產(chǎn)量的影響，結(jié)果顯示蚯蚓能改善土壤微生物的功能，可以代替農(nóng)家糞肥改善溫室番茄連作質(zhì)量[31]。本試驗結(jié)果表明，蚯蚓原位堆肥(T2)處理的土壤細菌OTUs數(shù)量、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)整體上高于蚯蚓糞異位堆肥(T1)和CK (表1)，且其通過增加綠彎菌門、芽單胞菌門的相對豐度抑制了連作障礙相關(guān)的酸桿菌門和擬桿菌門(圖2)。這說明與蚯蚓異位堆肥相比，蚯蚓原位堆肥更能夠改善細菌群落組成、增加多樣性，且大大降低了前期農(nóng)業(yè)廢棄物原位還田后有害菌群增殖的風險，從而抑制了連作障礙的發(fā)生。

3.2 蚯蚓堆肥可改善連作土壤的肥力和理化性狀

在本試驗中，施用蚯蚓化解的牛糞顯著降低了堿性土壤的EC和pH, 提高了土壤中有機碳、全量氮磷鉀和速效氮磷鉀含量，在番茄種植壟上施用牛糞，將蚯蚓直接接種于牛糞的效果比使用蚯蚓腐解牛糞的效果更好(圖1)。Wang等[30]、Zhao等[34]的研究也得出類似的結(jié)果。蚯蚓原位堆肥處理能夠改善連作土壤的肥力和理化性狀，其原因可歸結(jié)為有機碳投入和蚯蚓活動兩方面：一方面，牛糞富含有機碳，其在土壤中的投入量多，不僅能直接提高土壤肥力，而且能改善土壤物理性狀(如降低容重、增加孔隙度、提高持水持肥力[30,34]；另一方面，活蚯蚓的吞食與挖掘活動，不僅可以疏松土壤并提高通氣性，而且能夠使土壤有機質(zhì)呈斑塊狀分布，并使有機質(zhì)與礦質(zhì)土混合形成富含有機質(zhì)的土壤微粒[35]。連作土壤施用適量蚯蚓糞可調(diào)節(jié)土壤酸堿度，降低總鹽分和電導率，一定程度上緩解土壤酸化、鹽漬化及養(yǎng)分比例失衡等問題。本試驗中，蚯蚓改良處理，均顯著提高了連作土壤的總氮、總磷、總鉀、速效氮、速效磷和速效鉀含量，這與商麗榮等[36]的研究結(jié)果一致。值得注意的是，蚯蚓原位堆肥處理在全部3茬的總有機碳(TOC)、速效氮(AN)、速效磷(AP)與速效鉀(AK)含量均顯著高于蚯蚓異位堆肥處理。此外，由相關(guān)RDA分析進一步表明，TOC、AN、AP與AK與放線菌門呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系。雖然放線菌門與變形菌門同樣有著較寬的生態(tài)幅[37]，但由于放線菌屬于富營養(yǎng)型革蘭氏陽性菌[38]，能夠分解蚯蚓堆肥中的殘存纖維素、木質(zhì)素，隨著有機質(zhì)含量的增加，蚯蚓原位堆肥的放線菌門會在第二、三茬多于蚯蚓異位堆肥發(fā)酵(圖2)。此外，蚯蚓原位堆肥形成的蚯蚓糞中有益微生物豐度高于蚯蚓異位堆肥，其能夠促進有機質(zhì)的分解和養(yǎng)分的礦化，是植物營養(yǎng)元素的活性庫[39]。

3.3 不同蚯蚓堆肥處理對連作土壤細菌群落組成的影響

有研究報道，赤子愛勝蚓腸道內(nèi)的細菌類群主要為放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門 、厚壁菌門、浮霉菌門[40]。當蚯蚓攝取土壤后，土壤在蚯蚓腸道內(nèi)的運輸過程是使土壤細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的關(guān)鍵[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，在門分類水平上，變形菌門、放線菌門 、厚壁菌門、硝化螺旋菌門等在連作土壤改良過程中起潛在的作用。微生物的生長活性通常受到土壤理化性質(zhì)的限制，在土壤理化性質(zhì)不同的區(qū)域微生物群落組成也不同[42]，本研究中不同蚯蚓堆肥處理均顯著提升了土壤養(yǎng)分含量，之前報道屬于富營養(yǎng)型細菌的變形菌門的絕大多數(shù)、擬桿菌門[43]在本研究中也都成為了優(yōu)勢種，這一點和前人的研究較為類似，即細菌在空間上分布主要由養(yǎng)分所驅(qū)動[44]。在屬水平上，芽孢桿菌屬豐度較高，與這個屬大多是需氧或兼性厭氧型的光合細菌有關(guān)[45]，而蚯蚓由于自身攝食、運動所形成的蚓觸圈，能夠在原位堆肥過程中形成疏松多孔的蚯蚓糞。這可能是蚯蚓原位堆肥處理的芽孢桿菌屬豐度高于蚯蚓異位堆肥的原因。前期研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門、放線菌門和厚壁菌門在有機質(zhì)礦化和營養(yǎng)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[42]。盡管部分研究認為土壤細菌在門水平的大體組成非常類似，均以變形菌門、酸桿菌門和放線菌門相對豐度為最高，總相對豐度達到56.6%～73.8%[43]，但是深入調(diào)查發(fā)現(xiàn)土壤和蚯蚓腸道樣品之間大約有33.3%的共享OTUs，其中放線菌門(占總序列的39.2%)、變形菌門(26.9%)和厚壁菌門(18.7%)是蚯蚓腸道內(nèi)最主要的3類細菌群落，土壤中的優(yōu)勢菌群主要是變形菌門(48.7%)、厚壁菌門(14.3%)、擬桿菌門(10.1%)和放線菌門(9.1%)[44]。本研究結(jié)果較有力地支持了上述結(jié)論。此外，部分研究所報道的“特殊性抑制”作用中的球孢鏈霉菌、丁香苷鏈霉菌等[46]本研究并未檢測到，仍需后期的深入研究。

3.4 不同蚯蚓堆肥處理對連作土壤細菌群落和代謝功能的影響

前期研究結(jié)果表明，連作土壤施用適量蚯蚓糞可提高果實維生素C和可溶性糖含量，降低硝酸鹽含量及總酸度，增大糖酸比，明顯改善品質(zhì)[29, 47–48]。本研究基于KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫的代謝功能分析，在連作土壤改良過程中，碳水化合物代謝途徑起到重要作用。同時對相對豐度排名前20的3級KEGG同源功能進行預(yù)測，得出C5-Branched dibasic acid metabolism不僅在蚯蚓改良處理，而且在蚯蚓處理中具有重要的作用。C5-Branched dibasic acid metabolism屬于二級代謝途徑碳水化合物的代謝途徑。再次驗證了碳水化合物代謝途徑在蚯蚓(糞)改良連作土壤中有重要的作用。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓原位堆肥處理富集到的萜類化合物的代謝路徑遠多于異位堆肥處理(圖3)，而萜類物質(zhì)一直都是重要的化感物質(zhì)，如Ladhar等[49]確定了兩個新的達馬烷型三萜化合物抑制醉花蝶屬植物種子萌發(fā)和幼苗生長，直至最近人們從放線菌中分離得到了一系列新穎的萜類化合物[50]。這可能是蚯蚓原位堆肥較蚯蚓異位堆肥改善土壤細菌群落組成和提升連作土壤質(zhì)量的原因之一。此外，?imek和Pill的室內(nèi)試驗研究表明，在蚯蚓的體表和腸道中有固氮菌的出現(xiàn)[51]；而在紅壤中添加不同量的蚯蚓糞時也發(fā)現(xiàn)，NO3–含量隨蚯蚓添加量顯著升高[52]。而本研究代謝功能分析也檢測到了關(guān)于氨基酸的代謝路徑。該部分結(jié)果從側(cè)面印證了蚯蚓堆肥平衡了由于連作造成的土壤養(yǎng)分失調(diào)，改善了土壤理化條件，有效促進了土壤微生物生長，進而改善了土壤微生物量碳氮比例[35]。這其中土壤中的蛋白酶和蔗糖酶活性、含量變化則需要更進一步地探究。

4 結(jié)論

蚯蚓異位堆肥和原位堆肥均顯著降低了土壤EC值，提高了土壤有機質(zhì)、全量氮磷鉀和速效氮磷鉀含量，增加連作番茄土壤細菌多樣性，改善土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和代謝功能。

蚯蚓原位和異地堆肥顯著提高了土壤中變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門和硝化螺旋菌門的數(shù)量，降低了與連作障礙相關(guān)的酸桿菌門和擬桿菌門的數(shù)量。相較于化肥和蚯蚓異位堆肥，蚯蚓原位堆肥顯著增加了綠彎菌門、芽單胞菌門的相對豐度，因而緩解連作障礙的效果更佳。因此，在實際生產(chǎn)中，推薦蚯蚓原位堆肥以獲得更好的緩解連作番茄土壤次生鹽漬化與堿化的效果，并降低有機肥的使用成本。