異種蛋白誘導法建立IgA 腎病動物模型研究進展

楊 文 ,宋 丹 ,宋純東 ,郭 婷 ,段鳳陽 ,王寧麗 ,張 博,楊 濛

(1.河南中醫藥大學兒科醫學院,鄭州 450046;2.河南中醫藥大學,鄭州 450046;3.河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科,鄭州 450003)

IgA 腎病(IgA nephropathy,IgAN)是我國最為常見的原發性腎小球疾病,以免疫球蛋白 A(immunoglobulin A,IgA)或IgA 免疫復合物(immune complex,IC)沉積于腎小球系膜區為特征[1]。臨床主要表現為血尿,部分患者可出現蛋白尿[2]。全球IgAN 約占原發性腎小球疾病的52.66%[3],約30%～40%的IgAN 患者最終會進展為終末期腎病[4]。其發病機制迄今尚不完全明確,亦無特效治療方案。由于倫理所限,學者們多通過建立IgAN動物模型不斷探索此病。動物模型是研究疾病的重要載體,理想的動物模型是研究疾病發病機制或藥物療效的前提。IgAN 動物模型主要包括4 種,即免疫誘導型、自發病變型、繼發病變型、糖基化缺陷型。其中免疫誘導型動物模型根據誘導劑種類不同可分為異種蛋白誘導、病原微生物誘導、免疫復合物誘導3 種類型,異種蛋白誘導法所建立的IgAN動物模型由于模型病理改變與人類相似、經濟成本低而被國內學者廣泛采用。然而,醫學界關于此法建立IgAN 動物模型的用藥劑量及給藥時間的意見尚不統一[5]。目前,國外學者多采用自發病變型IgAN 動物模型,造模成本較高。基于此,本文對異種蛋白誘導法構建IgAN 動物模型展開綜述,以期為研究者建立IgAN 動物模型提供參考。

目前國內多采用異種蛋白誘導法構建IgAN 動物模型[6],即口服牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)誘導動物體內產生過量的IgA 分子,沉積于腎小球系膜區誘發IgAN[7]。IgAN 動物模型成功建立主要表現為血尿、腎功能下降等,光鏡下顯示系膜細胞增生、系膜基質增多,免疫熒光檢測可見腎小球系膜區IgA 大量沉積。該模型可用于研究IgAN 的發病機制、治療方案等。

1 溯源及改良過程

1.1 溯源

IgAN 動物模型由Rifai 等[8]最早建立,國內IgAN 動物模型的建立,最早可追溯至1988 年王麗等[9]使用BSA 口服,建立以輕度系膜增生為特征的腎病模型,造模后小鼠腎出現IgA 熒光強度增強,電鏡下電子致密物沉積,系膜基質增生,為該模型的建立奠定了基礎。

1.2 異種蛋白誘導建立IgAN 動物模型改良過程

1996 年,劉震等[10]通過對比4 種不同造模方法,提出采用口服BSA+尾靜脈注射SEB+皮下注射弗氏佐劑,所建立的大鼠增殖性腎小球腎炎模型病變最典型。該研究通過口服BSA 誘導動物體內產生過量的IgA 分子,沉積于腎小球系膜區誘發IgAN,弗氏佐劑用于增強BSA 免疫原性,加速腎組織病理改變。該模型造模時間短,系膜增生明顯,亦因實驗時間僅8 周可能影響結果的判定。

聶莉芳等[11]認為,在口服BSA 誘導胃腸粘膜免疫的基礎上加以靜脈注射BSA 誘導的IgAN 模型更符合人類特征,進一步改進了IgAN 造模方法。具體方法:于第1～6 周按200 mg/kg 隔日口服BSA(以0.1%鹽酸酸化水稀釋),于第6 周開始隔日1 次按20 mg/kg 尾靜脈注射BSA,連續注射3 次,以后仍隔日口服200 mg/kg BSA 到第12 周末。該方法采用口服加尾靜脈注射BSA,目的在于增強胃腸粘膜免疫反應。該造模方法易于操作,在12 周末模型出現蛋白尿,病理切片可觀察到系膜細胞增生,系膜基質增多,系膜區有IgA、免疫球蛋白G(immunoglobu-lin G,IgG)、補體C3沉積,但數量有限。此模型通過反復給模型鼠灌服0.1%的稀鹽酸酸化水,破壞具有堿性環境的腸道粘膜,進而促進免疫球蛋白IgA 抗體的產生,形成大量免疫復合物(immune complex,IC)。此后,宋純東等[12]、趙刃等[13]皆參考此法成功復制IgAN 動物模型。然而,此模型所引起的血尿與IgAN血尿的發生機制有所差別。

南方醫科大學南方醫院彭偉等[14]通過對比兩種不同的造模方法,A 組口服BSA+靜脈注射SEB+注射弗氏佐劑,B 組口服BSA+靜脈注射SEB+注射弗氏佐劑+皮下注射CCl4,發現B 組大鼠系膜增生較A 組明顯,IgA 分子沉積強度更高。該研究將口服BSA 劑量增加至400 mg/kg,SEB 劑量減少至0.3 mg/kg,增強了免疫原性,降低了毒性,將CCl4由腹腔注射改為皮下注射且劑量減半,減輕了其肝損傷,兩組對比證明了B 組血尿、蛋白尿出現更早,模型組腎病理改變更為顯著。但由于BSA 劑量仍較低且SEB 毒性較大,該方法所建立的IgAN 動物模型仍不理想。

考慮到SEB 毒性較大,湯穎等[15]進一步改進IgAN 動物模型,聯合應用 BSA+脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)+CCl4造模。造模方法:BSA(400 mg/kg,連續6 周隔天灌胃)+LPS(分別于第6、8 周尾靜脈注射LPS 0.05 mg)+CCl4(下注射CCl40.1 mL+蓖麻油0.5 mL,每周1 次,持續9 周)。該法以LPS 代替SEB,BSA 劑量較前增加一倍,CCl4給藥方法改為皮下注射且減少劑量至誘導肝硬化劑量的1/3。該模型動物成模率高,可重復性強,目前國內研究者復制IgAN 動物模型多沿用此法。然而,該模型在造模時長、藥物劑量上仍存在爭議。

陸慧瑜等[16]對湯穎等[15]的造模方法進一步改進,具體方案為:持續8 周隔日灌胃BSA 400 mg/kg,每周一次皮下注射蓖麻油0.3 mL+CCl40.1 mL 持續9 周,于第6 周尾靜脈注射LPS 0.05 mg。該方案將隔日灌服BSA 的時間由6 周改為8 周,以增強動物免疫原性,尾靜脈注射LPS 由2 次改為1 次以減輕LPS累計毒性對模型的損傷,加速模型大鼠腎病變的同時降低死亡率,9 周后成功建立IgAN 動物模型。

為精準把握造模劑量與時長,有學者提出BSA+LPS+CCl4分劑量、時間造模法[17],即將BSA分為高劑量組(600 mg/kg) 和低劑量組(400 mg/kg)隔日灌胃,并在第8 周和12 周觀察病理變化。實驗發現,造模8 周后,大鼠腎病理出現系膜細胞和系膜基質輕度增生,12 周末更為顯著并伴輕度腎間質纖維化,低劑量組病變較輕,12 周末可見免疫熒光,高劑量組熒光表達強于低劑量組。BSA+LPS+CCl4造模法,可在12 周建立病理表現及生化指標趨近人類IgAN 的動物模型,且高劑量BSA(600 mg/kg)模型更為典型。

為解決在不同時間節點、口服不同劑量BSA、BSA 溶劑不同以及在不同節點注射免疫佐劑對建立IgAN 大鼠模型影響有差異這些問題上存在的爭議,馬思佳等[18]將酸化水作為BSA 溶劑,將BSA 分400 mg/kg 和600 mg/kg 兩種劑量對大鼠進行灌胃,分多個時間節點尾靜脈注射LPS。該研究通過對比發現,純化水與酸化水相比作為溶劑效果更加突出,隔日灌服以純化水溶解的高劑量BSA(600 mg/kg),每周1 次皮下注射CCl4,連續12 周,聯合第8、10 周每周1 次尾靜脈注射LPS 所建立的IgAN 大鼠模型更接近人類病理。該實驗造模成功率高于90%,在操作過程中無大鼠死亡,所提出的造模方法是有待進一步驗證。

諸多臨床和實驗研究表明,腸粘膜免疫系統的激活是IgAN 的重要發病機制,腸-腎軸也參與IgAN的發病[19-22],故有學者提出將異種蛋白加入到飲用水中喂養動物以激活免疫反應[23]。Zou 等[24]將牛丙種球蛋白(bovine gamma globulin,BGG)加入飲用水中喂養動物9 周,12 周后模型出現明顯的蛋白尿,腎病理見系膜細胞和系膜基質彌漫性增殖,免疫熒光顯示大量IgA 沉積,提示造模成功。通過自由飲水建立動物模型,動物存活率高,實驗可重復性強,但無法控制飲水量可能會對模型造成影響,且模型未出現明顯血尿。

近年來,隨著胸腺肽被廣泛應用于各種疾病的輔助治療中,有學者嘗試將胸腺肽應用于建立IgAN動物模型。胸腺作為人體重要的免疫器官,其中存在大量免疫細胞,可分泌抗體。胸腺肽可促進胸腺發育,增強機體免疫,使免疫細胞產生的抗體增多。基于此,高明等[25]對IgAN 動物模型進行改進,造模方法為:持續12 周隔天灌胃BSA 600 mg/kg,每周皮下注射CCl40.1 mL、蓖麻油0.3 mL 及胸腺肽3 mg,分別于第6、8、10 周尾靜脈注射LPS 0.05 mg。觀察12 周后大鼠均出現蛋白尿,并可見典型病理改變,驗證了造模成功。與其他模型相比,該研究首次將胸腺肽用于建模,增強了模型的免疫反應。該模型免疫熒光強度較強,且病理與人IgAN 相似,操作簡單,造模成功率高,但大部分模型病理僅呈輕至中度病變,未能出現重度系膜增生、新月體形成等病變,仍需進一步探索。

以上是目前常見的學者們運用異種蛋白誘導法建立IgAN 動物模型的方法,通過異種蛋白誘導造模機制復雜,造模能否成功易受多種因素影響,如動物實驗室環境、研究員專業素養、動物自身耐受性、藥物等。此外,導致異種蛋白誘導法造模失敗還有一個重要原因在于動物本身存在一定的自愈能力。在實驗過程中,若已造模成功的動物長時間未再次給予外源性抗原,體內的免疫細胞可能會將原有IC 清除,從而導致造模失敗。實驗動物的個體差異性也可能導致模型病變程度不一,病理結果有輕有重,不易控制。模型總結見表1。

表1 IgAN 常見動物模型總結Table 1 Summary of common animal models of IgAN

續表1

2 模型間的異同點

總結上述動物模型的異同點,以供讀者參考,具體如下:(1)實驗動物主要有大鼠、小鼠,其中SD雄性大鼠最為常用。(2)實驗動物大致為6～8 周齡。(3)造模時長不等,造模時長最短為8 周,最長造模時長可達12 周。(4)造模方法上均采用異種蛋白誘導法造模,造模均通過口服聯合注射藥物誘發動物機體免疫反應增強、IC 沉積于腎小球系膜區,具體藥物種類、劑量、給藥時間各有不同。(5)判斷造模成功的方法主要集中在以下方面:①一般情況:體重、毛發、精神、食欲、飲水量、尿量及氣味、糞便顏色等;②實驗室指標:血常規、尿常規、肝功能、腎功能、24 h 尿蛋白定量、炎癥因子、循環IC 等;③腎病理:光鏡、免疫熒光、電鏡。

3 IgAN 中醫研究模型改良思路

IgAN 是以系膜區大量沉積IgA 或IgAIC 為病理特征的原發性腎小球疾病,血尿為其主要臨床表現,可兼有蛋白尿、高血壓等[26]。在中醫古籍中并未記載有IgAN 的病名,但根據其臨床表現可歸屬于“尿血”、“虛勞”、“腰痛”、“腎風”等范疇[27]。其病因無外乎先天稟賦不足與外感病邪兩個方面,異種蛋白誘導法造模主要通過影響后天來制備模型。然而目前此法成模評判標準多采用病理評價方法,即以病理作為診斷的金標準,對病證結合模型探索甚少。中醫強調辨證論治,同病異治和異病同治的實質是通過逆轉證的變化來改變疾病發展趨勢,辨證選方治療可顯著提高治療有效率,大幅度改善模型實驗室指標及病理結果[28]。現有的免疫異種蛋白誘導法建立IgAN 動物模型,模型穩定性好,但證候可控性差,無法確保得到實驗研究所對應的證型,以此為基礎的中藥療效評價說服力有限。

因此,將病因、癥狀、體征等中醫要素與現代醫學之客觀指標有機統一起來建立病證結合模型是進一步改良IgAN 模型的必然要求。構建病證結合模型要盡可能貼近臨床,將疾病造模因素與證候造模因素相結合,充分考慮到環境、體質、飲食、情志等因素對機體的影響,提高造模成功率[29]。同時,要不斷完善證候評價體系,探索建立模型動物四診信息客觀化采集方法,以保證模型的穩定性。

4 結語

綜上,IgAN 發病機制復雜,其動物模型建立方法尚未完全統一,目前尚無與人類IgAN 臨床表現及病理特征完全一致的動物模型。經過學者們的不斷探索,提出了多種IgAN 模型的造模方法,方法各有千秋。雖然異種蛋白誘導法建立IgAN 動物模型可操作性及重復性強,但造模過程中易受多種因素影響,且因動物本身有自愈能力而存在誘導失敗的可能。此外,現有造模方法評價標準單一,尚無研究者提出病證結合模型。

IgAN 動物模型是研究IgAN 發病機制、診斷、治療的前提,相信隨著現代醫學的進步和人們對IgAN病理機制的深入探究,IgAN 實驗動物模型會不斷革新,愈加符合人類特征。