冠心病患者血清長鏈非編碼RNA H19和微小RNA-22表達水平及其臨床意義研究

高珩，李媛媛，郭鋒偉，王雪

冠心病（coronary heart disease，CHD）主要由沉積在血管中的脂質形成粥狀白色斑塊引起［1］。隨著血管中脂質沉積量的增加，血液循環受阻，進而導致心臟缺血［2］。據報道，我國CHD患者每年的死亡率約為0.11%，是影響公民健康的重要危險因素［3］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是兩類非編碼RNA，是細胞轉錄水平及轉錄后水平的調控因子，研究表明lncRNA和miRNA在心血管疾病的發生發展及診斷治療中具有重要作用［4-5］。另外，炎性反應也是導致冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩定的原因，是CHD發生的重要機制［6］。實驗證實，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、內皮素1（endothelin 1，ET-1）、白介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）以及超敏C反應蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）與CHD的發生密切相關［7］。本研究旨在探究lncRNA H19和miR-22在CHD患者血清中的表達水平及其對CHD的診斷價值、與炎性因子水平的相關性，以期為臨床CHD的診斷和治療提供一定理論支持。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年6月至2021年6月在陜西省人民醫院就診的CHD患者113例作為試驗組，并選擇同期于本院體檢的健康志愿者88例作為對照組。試驗組納入標準：（1）符合第8版《內科學》［8］中CHD的診斷標準，且造影顯示至少1支冠狀動脈狹窄≥50%；（2）臨床資料完整；（3）年齡35～75歲。排除標準：（1）合并惡性腫瘤者；（2）近3個月內有外科手術史或創傷史者；（3）嚴重肝腎功能障礙者；（4）合并嚴重自身免疫性疾病，或服用免疫抑制劑者；（5）合并血液傳染性疾病或近期有中重度感染者。對照組納入標準：（1）年齡35～75歲；（2）無心力衰竭、CHD、先天性心臟病、大動脈炎等心血管相關疾病。排除標準：（1）嚴重肝腎功能障礙者；（2）合并惡性腫瘤或不能控制的高血壓者；（3）有嚴重腦栓塞、腦出血病史者；（4）合并自身免疫性疾病或近半年服用免疫抑制劑者；（5）合并中重度血液傳染性疾病者。試驗組中男62例，女51例；年齡35～75歲，平均（54.6±8.8）歲。對照組中男45例，女43例；年齡35～73歲，平均（53.2±7.4）歲。兩組受試者性別（χ2=0.277，P=0.599）、年齡（t=1.021，P=0.076）比較，差異無統計學意義。本研究經陜西省人民醫院倫理委員會批準同意，受試者均對本研究知情同意。

1.2 RT-PCR檢測受試者血清lncRNA H19、miR-22表達水平 采集受試者清晨空腹外周血5 ml，3 000 r/min離心15 min（離心半徑為10 cm），取血清；采用RNA提取試劑盒（GenEluteTM，Sigma）提取血清總RNA；采用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測RNA濃度和純度，檢測合格后取1 g 總RNA反轉錄為cDNA〔InRcute lncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，KR202-01；miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，KR211；天根生化科技（北京）有限公司〕；采用RT-PCR檢測lncRNA H19、miR-22表達水平，嚴格按照Quant SYBR Green PCR試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕操作；引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，分別以β-actin和U6為內參。PCR條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。每個實驗設置3個復孔，反應結束后采用2-ΔΔCt法計算lncRNA H19、miR-22表達水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 ELISA法檢測血清炎性因子、內皮功能指標水平 采用ELISA檢測血清炎性因子、內皮功能指標水平，前者包括IL-6、TNF-α、hs-CRP，后者包括VEGF、ET-1，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據處理和分析。符合正態分布的計量資料以（x± s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用ROC曲線評估血清lncRNA H19、miR-22表達水平及其聯合診斷CHD的價值；兩變量間的相關性分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者血清lncRNA H19、miR-22表達水平比較 試驗組患者血清lncRNA H19、miR-22表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組受試者血清lncRNA H19、miR-22表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum expression level of lncRNA H19 and miR-22 between the two groups

表2 兩組受試者血清lncRNA H19、miR-22表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum expression level of lncRNA H19 and miR-22 between the two groups

組別 例數 lncRNA H19 miR-22對照組 88 1.14±0.40 1.05±0.28試驗組 113 1.87±0.44 1.59±0.43 t值 -9.871 -10.529 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 兩組受試者血清炎性因子、內皮功能指標水平比較 試驗組患者血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組受試者血清炎性因子水平、內皮功能指標水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum levels of inflammatory factors and endothelial function indexes between the two groups

表3 兩組受試者血清炎性因子水平、內皮功能指標水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum levels of inflammatory factors and endothelial function indexes between the two groups

注：IL-6=白介素6，TNF-α=腫瘤壞死因子α，hs-CRP=超敏C反應蛋白，VEGF=血管內皮生長因子，ET-1=內皮素1

E T-1（n g/L）對照組 8 8 3 8.8±1 3.5 1 1.8±4.7 6.5±1.7 9 5.8±3 5.3 4 7.9±1 0.6試驗組 1 1 3 1 3 2.5 ±1 6.8 3 7.6±5.4 1 9.4±5.6 5 3 5.6±9 3.8 1 0 9.0±2 3.6 t值 1 2.5 5 7 1 2.7 4 8 8.6 3 2 1 5.3 5 9 1 0.8 6 5 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1組別 例數 I L-6（n g/L）T N F-α（n g/L）h s-C R P（m g/L）V E G F（n g/L）

2.3 血清lncRNA H19、miR-2表達水平及其聯合診斷CHD的價值 ROC曲線分析結果顯示，血清lncRNA H19、miR-22表達水平及其聯合診斷CHD的AUC分別為0.827〔95%CI（0.770，0.884）〕、0.817〔95%CI（0.758，0.876）〕、0.894〔95%CI（0.850，0.938）〕，最佳截斷值分別為1.44、1.39、0.64，靈敏度分別為78.1%、65.8%、76.3%，特異度分別為79.4%、85.2%、89.8%，Youden指數分別為0.565、0.510、0.661，見圖1。

圖1 血清lncRNA H19、miR-22表達水平及其聯合診斷CHD的ROC曲線Figure 1 ROC curve of serum expression level of lncRNA H19, miR-22 and their combination for the diagnosis of CHD

2.4 CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達水平與炎性因子、內皮功能指標水平的相關性分析 CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達水平與IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平均呈正相關（P＜0.05），見表4。

表4 CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達水平與炎性因子、內皮功能指標水平的相關性Table 4 Correlation between serum expression level of lncRNA H19,miR-22 and levels of inflammatory factors, endothelial function indexes in CHD patients

3 討論

CHD是嚴重影響人類健康的重要疾病之一，近年來其發病率逐漸上升，且發病年齡越來越年輕化。世界上80%以上的心臟猝死是由CHD引起的，其余病例是由其他疾病引起的，包括心肌病、先天性心臟病、左心室肥厚、主動脈瓣疾病和其他心臟病［9］。目前CHD的診斷和治療已取得較大的進步，但每年CHD的發病率及死亡率仍不容忽視［10］。所以，CHD的早期預防和診斷對于降低其病死率尤為重要。

lncRNA是一類長度為200 nt的非編碼RNA，其可在轉錄或轉錄后調控細胞分化、增殖、自噬等過程。既往研究表明，lncRNA與心血管疾病有關［11-13］。同樣，miRNA是一類包含約22個核苷酸的內源性非編碼RNA，其通過誘導mRNA降解或阻斷翻譯來轉錄和控制基因表達，與各類疾病（包括心血管疾病）的發生有關［14-15］。本研究結果顯示，試驗組患者血清lncRNA H19、miR-22表達水平高于對照組，提示CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達水平升高。且血清lncRNA H19、miR-22表達水平及其聯合診斷CHD的AUC分別為0.827、0.817、0.894，最佳截斷值分別為1.44、1.39、0.64，靈敏度分別為78.1%、65.8%、76.3%，特異度分別為79.4%、85.2%、89.8%，Youden指數分別為0.565、0.510、0.661，表明血清lncRNA H19表達水平聯合血清miR-22表達水平對CHD的診斷價值更高。仉慧穎等［16］研究發現，CHD患者血清lncRNA H19表達水平升高，且其對CHD的發生有明顯的促進作用，本研究結果與之相似。有研究發現，與完全無動脈粥樣硬化的急性心肌梗死組織相比，冠狀動脈粥樣硬化斑塊中，miR-22表達水平明顯升高［17］。所以lncRNA H19和miR-22在CHD的發生中有重要作用。

ZHANG等［5］進一步探究lncRNA對CHD的調控機制發現，lncRNA ANRIL可作為促進WDR5和HDAC3結合形成WDR5和HDAC3復合物的分子支架，其通過上調活性氧水平，促進人主動脈平滑肌細胞表型轉化。還有研究表明，lncRNA MALAT1在CHD患者血清和內皮祖細胞中過度表達，并且其可通過調控miR-15b-5p/MAPK信號軸和mTOR信號通路來抑制內皮祖細胞自噬，提高細胞活力，同時抑制心肌細胞凋亡［18］。lncRNA可以作為miRNA的“分子海綿”，進而形成競爭性內源RNA（ceRNA）調控網絡，影響細胞生物學行為；或直接通過介導細胞信號通路，或通過表觀遺傳學而影響生物學過程［19-20］。以上研究表明，lncRNA、miRNA在CHD的發生中有非常重要的意義，且不同的lncRNA和miRNA在CHD的發生中作用不同。后續實驗需要進一步從細胞生物學層面探究lncRNA H19和miR-22對CHD發生的調控機制。

CHD的發病機制過于復雜，但通常為動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）引起的管腔狹窄或閉塞，從而阻礙正常血液循環。研究表明，炎性反應在AS的發生和發展中起著重要作用。血管炎性反應可改變血管壁的形狀，引發血栓形成，并促進AS斑塊從穩定狀態轉變為脆弱狀態，從而誘發栓塞并引發各種心腦血管疾病［21］。有研究表明，lncRNA、miRNA與CHD患者血清炎性因子水平有一定相關性［22］。劉俊逸等［23］研究表明，LncRNA TUG1與血清炎性因子IL-6水平呈正相關。本研究結果顯示，試驗組患者血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平高于對照組，且CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達水平與IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平均呈正相關，提示lncRNA H19和miR-22可通過調控炎性因子、內皮功能指標水平而影響CHD的發展。

綜上所述，CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達水平升高，其對CHD有一定診斷價值，且二者聯合的診斷價值更大；此外，其與血清炎性因子、內皮功能指標水平均呈正相關。但本研究未探討血清lncRNA H19、miR-22表達水平與CHD患者疾病嚴重程度及預后的相關性，在后期可通過隨訪數據進一步研究。

作者貢獻：高珩進行文章的構思與設計，撰寫論文，進行統計學處理并對文章整體負責、監督管理；王雪進行研究的實施與可行性分析、論文修訂；高珩、李媛媛進行資料收集；郭鋒偉進行資料整理；高珩、王雪負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。