通脈養心丸治療不同性別老年冠心病患者的分子機制研究

李子瀅，王國佐，黃娟，秦莉花，，李晟

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病又稱冠心病，是冠狀動脈發生粥樣硬化病變而引起的血管管腔狹窄或阻塞，導致心肌缺血、缺氧或壞死的一種心臟病。美國心臟病協會的統計數據顯示，2011—2014年美國≥20歲成年人冠心病總患病率為6.3%，2015年美國冠心病死亡人數達366 801例；推測2018年美國約72萬人將首發冠心病，33.5萬人將復發冠心病；在發達與不發達國家，冠心病仍是造成死亡的主要原因，嚴重威脅人類的生命及身體健康［1］。目前，中國心血管疾病患病率及死亡率仍處于上升階段，位居城鄉居民總死亡原因的首位，2018年中國心血管疾病患病人數已高達3.3億［2-3］。在過去的20年里，越來越多的證據表明心血管疾病風險存在性別差異，女性冠心病發病時間較男性晚10～15年，女性冠心病發生率在絕經前僅是男性的1/10～3/10，絕經后則迅速升高［4］。與男性冠心病患者相比，女性冠心病患者心血管復合終點事件和復發風險均較低，但心力衰竭、全因死亡率較高［5］。故關注冠心病的性別差異具有一定的臨床意義。

專利藥物通脈養心丸在中國已被廣泛用于治療冠心病，其抗炎作用是治療冠心病的潛在機制之一［6］，但其具體的作用機制仍不清楚。本研究采用生物信息學方法分析通脈養心丸治療不同性別老年冠心病患者的分子機制，以期為冠心病的治療和中藥復方的研發提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數據集的獲取 2021年6—10月，從基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus datasets，GEO）下載GSE142008數據集，平臺號為GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。本研究從GSE142008數據集選取老年冠心病患者12例，年齡≥60歲。將治療前3例女性患者、3例男性患者的外周血單個核細胞樣本作為對照組，通脈養心丸治療后3例女性患者、3例男性患者的外周血單個核細胞樣本作為實驗組。

1.2 數據預處理及差異基因的篩選 采用R 3.6.3軟件進行數據的統計分析與可視化。使用ggplot2包（3.3.3版本）繪制樣本數據歸一化的箱式圖。差異基因的篩選參數標準為|log2（FC）|＞1，校正P值＜0.05。使用ComplexHeatmap包（2.2.0版本）繪制熱圖［7］，以直觀地展示各差異基因在每個樣本中的表達情況；使用ggplot2包（3.3.3版本）繪制數據火山圖，以直觀地展示差異基因的分布情況。

1.3 蛋白質互作網絡（protein-protein interaction networks，PPI）的制作及關鍵基因的選取 參考文獻［8］，利用STRING數據庫（http：//string-db.org）對差異基因制作PPI，蛋白互作分數閾值為0.40，將所得結果導入Cytoscape軟件（3.8.2版本）中的MCODE、cytoHubba插件以篩選基因，再利用韋恩圖在線工具將篩選出來的基因進行對比以獲得關鍵基因。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 使用R 3.6.3軟件進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，其中org.Hs.eg.db包（3.10.0版本）用于ID轉換，clusterProfiler包（3.14.3版本）［9］用于富集分析，ggplot2包（3.3.3版本）用于可視化及可視化網絡圖制作。以校正P值＜0.05、q值＜0.2為閾值篩查差異基因的主要富集功能和通路。

2 結果

2.1 數據預處理結果 各個樣本中位數基本在一個水平線上，提示樣本間歸一化程度好，見圖1。

圖1 不同性別老年冠心病患者樣本數據的箱式圖Figure 1 Box plot of sample data of elderly patients with coronary heart disease of different genders

2.2 差異基因篩選結果 老年女性冠心病患者治療前后比較差異基因有796個，其中高表達776個、低表達20個；老年男性冠心病患者治療前后比較差異基因有1 159個，其中高表達1 117個、低表達42個，見表1、圖2～3。

圖2 不同性別老年冠心病患者差異基因的火山圖Figure 2 Volcano plot of differential genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders

圖3 不同性別老年冠心病患者差異基因的熱圖Figure 3 Thermogram of differential genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders

表1 不同性別老年冠心病患者治療前后比較排名前10位的上調和下調差異基因Table 1 The top 10 up-regulated and down-regulated differential genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders before and after treatment

2.3 PPI及關鍵基因選取結果 在老年女性冠心病患者中，MCODE插件分析結果顯示，一共有16個聚類，選擇分數最高的聚類1，得分為25分、節點為25個、邊數為300條，篩選出的基因為LONRF1、FBXL3、LTN1、KBTBD7、UBE2E1、UBE2Q2、UBE2J1、FBXL5、HACE1、RNF6、UBE2W、RNF138、BTBD1、UBA3、TCEB1、CUL5、UBE2V2、MEX3C、FBXO11、ZNRF2、RCHY1、UBR1、PJA2、UFL1、RNF14，見圖4A；cytoHubba插件分析結果顯示，按照得分由高到低的基因依次為BTBD1、FBXL5、KBTBD7、FBXL3、FBXO11、CUL5、TCEB1、UBA3、LTN1、UBR1，見圖5A。最終選取的關鍵基因為BTBD1、FBXL5、KBTBD7、FBXL3、FBXO11、CUL5、TCEB1、UBA3、LTN1、UBR1。

在老年男性冠心病患者中，MCODE插件分析結果顯示，一共有25個聚類，選擇分數最高的聚類1，得分為34分、節點為34個、邊數為561條，篩選的基因為KCTD6、FBXL5、RCHY1、UBE2E1、FBXW7、UBE2Q2、UBE2J1、CUL3、SIAH1、UBE2V2、HACE1、BTBD1、RNF111、RNF138、KLHL2、UBE2W、MEX3C、UBE2D1、LONRF1、ANAPC4、HERC4、CUL5、PJA2、RNF6、KBTBD6、KBTBD7、UBE2A、UFL1、UBA3、LTN1、KLHL9、UBR1、ARIH2、FBXL3，見圖4B；cytoHubba插件分析結果顯示，按照得分由高到低的基因依次為PJA2、LTN1、BTBD1、CUL3、ANAPC4、UBR1、RNF138、HACE1、SIAH1、UBE2D1，見圖5B。最終選取的關鍵基因為PJA2、LTN1、BTBD1、CUL3、ANAPC4、UBR1、RNF138、HACE1、SIAH1、UBE2D1。

圖4 MCODE插件分析結果Figure 4 Analysis results of MCODE plugin

圖5 cytoHubba插件分析結果Figure 5 Analysis results of cytoHubba plugin

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果 在老年女性冠心病患者中，GO功能富集分析結果顯示，關鍵基因主要富集于翻譯后的蛋白質修飾、蛋白酶體介導的泛素依賴性蛋白質分解代謝過程等生物過程；泛素連接酶復合物、cullin-RING泛素連接酶復合物等細胞組成；泛素樣蛋白轉移酶活性、泛素蛋白連接酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析結果顯示，關鍵基因主要與泛素介導的蛋白水解、晝夜節律通路相關，見表2、圖6A、圖7A。

在老年男性冠心病患者中，GO功能富集分析結果顯示，關鍵基因主要富集于蛋白酶體介導的泛素依賴性蛋白質分解代謝過程、蛋白酶體蛋白質分解代謝過程等生物過程；泛素連接酶復合物、cullin-RING泛素連接酶復合物等細胞組成；泛素蛋白轉移酶活性、泛素樣蛋白轉移酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析結果顯示，關鍵基因主要與泛素介導的蛋白水解通路相關，見表2，圖6B、圖7B。

圖6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的柱狀圖Figure 6 Histogram of GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis

圖7 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的可視化網絡圖Figure 7 Visual network diagram of GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis

表2 不同性別老年冠心病患者關鍵基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果Table 2 GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of key genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders

3 討論

冠心病歸屬于中醫學“心痛”“胸痹”等范疇，中醫藥運用于冠心病臨床治療的歷史悠久且療效顯著，應用前景廣闊［10］。通脈養心丸源于兩大經典方劑炙甘草湯和生脈散，其由地黃、雞血藤、甘草、五味子、麥冬等中藥材組成，具有益氣養陰、通脈止痛的功效，臨床上用于治療胸痛、心痛、氣陰兩虛型冠心病等［11］。既往研究表明，通脈養心丸可通過保護心肌細胞及血管內皮細胞、抑制炎性因子表達等有效治療冠心病，但其具體的作用機制仍有待進一步研究［12］。因此，研究通脈養心丸治療冠心病的分子機制，對冠心病的臨床治療及通脈養心丸的推廣和二次開發具有重要的臨床意義。

本研究以治療前患者外周血單個核細胞樣本為對照組，通脈養心丸治療后患者外周血單個核細胞樣本為實驗組，最終篩選出關鍵基因，結果顯示，老年女性冠心病患者的關鍵基因為BTBD1、FBXL5、KBTBD7、FBXL3、FBXO11、CUL5、TCEB1、UBA3、LTN1、UBR1；老年男性冠心病患者的關鍵基因為PJA2、LTN1、BTBD1、CUL3、ANAPC4、UBR1、RNF138、HACE1、SIAH1、UBE2D1。通脈養心丸可能主要通過調控以上基因的表達來治療冠心病。BTBD1是一種含有BTB結構域的蛋白，與DNA拓撲異構酶1相互作用，參與肌生成的過程和泛素/蛋白酶體降解途徑，該過程和途徑與心血管疾病密切相關［13］。FBXL5被鑒定為SCF泛素連接酶復合物的底物受體亞基，缺乏FBXL5表達的細胞無法識別其鐵代謝狀態，從而不斷積累有毒的生物可利用鐵［14］，而高水平的儲存鐵能夠增加冠心病發病風險［15］。KBTBD7參與炎性因子的表達調控，能夠抑制炎癥反應［16］，而炎癥因子及炎癥反應與冠心病發病有關。FBXL3是SCF泛素連接酶復合物的一部分，主要在細胞核內發揮作用，其可以通過與隱花色素蛋白結合來影響負反饋環，加速哺乳動物的SCF復合物介導的多泛素化和隨后的蛋白酶體降解，從而維持哺乳動物的晝夜節律［17］。FBXO11屬于泛素連接酶E3家族，有研究表明，FBXO11可以通過破壞缺氧誘導因子1α mRNA來抑制細胞對缺氧的反應［18］。本研究認為，通脈養心丸可通過FBXO11在心肌細胞缺氧過程中起保護作用，從而影響冠心病的疾病進程和患者預后。CUL5是泛素連接酶復合物中的一種支架蛋白，其介導的內脂素可以保護人冠狀動脈內皮細胞免受損傷［19］。TCEB1即轉錄延伸因子B1，有研究表明，TCEB1是多囊卵巢綜合征的潛在治療靶點，而多囊卵巢綜合征可導致動脈粥樣硬化和心血管疾病［20］。UBA3可以抑制抗凝血酶的泛素化和降解，增加抗凝血酶蛋白表達水平［21］。LTN1通過靶向異常的新生多肽進行蛋白酶體降解，在核糖體相關蛋白質質量控制中發揮關鍵作用，與神經退行性疾病有關［22］。但目前尚未發現LTN1與冠心病之間的關系，本研究發現其是冠心病相關的新基因，但其具體作用及機制還需要進一步研究驗證。UBR1屬于E3泛素連接酶家族，對于心臟的發育至關重要，其缺陷會導致心血管的異常［23］。PJA2是一種泛素連接酶，是動脈粥樣硬化的樞紐基因，參與其發展過程［24］。CUL3對維持內皮屏障的完整性至關重要，CUL3突變的患者可表現出嚴重的早發性高血壓、血管功能障礙和動脈僵硬［25］。ANAPC4是細胞周期后期促進復合物的核心亞基之一，驅動細胞周期從中期到后期進展的一個重要調節因子［26］，而細胞周期的運行與冠心病存在密切聯系［27］。RNF138是一種DNA損傷反應蛋白，可參與DNA的損傷修復過程［28］，而DNA修復相關基因的缺陷可能與DNA損傷修復效能的差異有關，最終導致心血管事件的發生［29］。HACE1是一種E3泛素連接酶，可以通過參與自噬介導的蛋白質降解來對心臟起保護作用［30］。SIAH1是泛素蛋白連接酶的一種，可參與細胞自噬過程［31］。UBE2D1是三類泛素化酶之一，其有助于選擇性降解短壽命蛋白質或異常蛋白質［32］。

本研究GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果顯示，通脈養心丸在多條與冠心病相關的通路上發揮重要作用，在老年女性與男性冠心病患者中，其均與泛素介導的蛋白水解通路有關。研究表明，泛素介導的蛋白水解通路能夠防止患者動脈粥樣硬化病情進展［33］，從而進一步調控和緩解冠心病病情。泛素化對于自噬的誘導、調節和微調節至關重要［34］，而自噬是程序性細胞死亡的形式，參與冠心病的發生、發展和預后［35-36］。通脈養心丸中雞血藤中的黃酮類化合物與泛素-蛋白酶體途徑有關，可抑制蛋白酶體活性，從而介導動脈粥樣硬化的病理變化［37］。本研究組認為，通脈養心丸可通過調節女性患者CUL5、UBA3基因的表達，男性患者CUL3、SIAH1、UBE2D1基因的表達，來維持內皮屏障的完整性、抗動脈粥樣硬化、降低細胞死亡率等，從而達到治療疾病的目的。

在老年女性患者中，通脈養心丸治療冠心病還與晝夜節律通路相關。晝夜節律是指一種周期約為24 h的生物節律，與睡眠、飲食、情緒、代謝等多方面的功能有關［38-39］。女性雌激素受體受晝夜節律影響［40］，且介導雌激素可促進血管內皮細胞的生長或修復以及一氧化氮的釋放等，從而保護心血管系統［41］。研究表明，晝夜節律紊亂會影響心血管疾病的發生、發展［42］。通脈養心丸中的五味子能夠治療失眠類疾病［43］，雞血藤能夠調節失眠和抑郁情緒［16］，阿膠和大棗能夠提高雌激素水平［44-45］。本研究組認為，通脈養心丸可通過調節FBXL3的表達來調控晝夜節律，改善患者睡眠情況和情緒狀態，從而調節激素水平等，進而達到治療老年女性冠心病患者的目的。

綜上所述，通脈養心丸治療不同性別老年冠心病患者具有多靶點和多通路協調的特點，在老年女性患者中，其作用機制主要與泛素介導的蛋白質水解、細胞自噬、炎癥反應、鐵代謝、生物鐘、激素調節等有關；在老年男性患者中，其作用機制主要與泛素介導的蛋白質水解、細胞自噬、DNA損傷修復等有關。本研究對冠心病的臨床治療和通脈養心丸的二次開發提供了一定參考，但本研究是基于生物信息學方法進行的預測和分析，數據僅來源于GEO數據庫中所納入的治療前后不同性別患者的外周血單個核細胞樣本，研究結果可能存在一定偏倚，通脈養心丸治療冠心病的具體作用靶點和分子機制還需要進一步研究。

作者貢獻：秦莉花進行文章的構思與設計，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理；李子瀅撰寫、修訂論文；王國佐、黃娟負責資料收集、整理；李晟負責數據分析。

本文無利益沖突。