祛風通絡方對高糖誘導人腎小球系膜細胞炎癥反應的影響

蘇冠旬 李麗娜 陳 宇 趙博旭 張耀夫 趙進喜 黃為鈞 王世東

1.北京中醫藥大學東直門醫院腎病內分泌二科，北京 100010；2.北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029

糖尿病腎病（diabetic nephropathies，DN）是糖尿病常見的微血管并發癥之一，是導致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。DN 發病機制復雜，其中免疫炎癥損傷一直是DN 發病機制的研究熱點。研究表明，p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activation protein kinase，p38 MAPK）通路是腎臟免疫炎癥的重要途徑，在炎癥、纖維化和應激反應中都具有著重要作用[2-6]，其可以促進腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、細胞間黏附分子-1（intercelluar adhesion molecule-1，ICAM-1）等細胞因子表達，從而加劇DN 的惡化，而ICAM-1、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 等因子表達的增強能反作用于p38 MAPK 信號通路，促進通路的激活，加快腎纖維化的進展[7-10]。本課題組既往研究發現，祛風通絡方（牛蒡子、蠶砂、穿山龍）在治療DN 方面具有一定的效果，可降低尿蛋白、延緩腎小球纖維化，其機制與下調TGF-β1、MCP-1 等炎癥因子的表達有關[11-13]。為進一步從分子生物學角度揭示祛風通絡方治療DN 的機制及“從風論治”法治療DN 的合理性，本研究對祛風通絡方改善高糖誘導人腎小球系膜細胞炎癥反應的分子機制進行了分析。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株

人腎小球系膜細胞株，購自北京裕恒豐科技有限公司（貨號：4200），傳至第三代用于實驗。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 高糖DMEM 培養液（25 mmol/L 葡萄糖）（美國Hyclone 公司，批號：NVL0337）；低糖DMEM培養液（美國Hyclone 公司）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號：10099-141）；TNF-α、TGF-β1、IL-1β、IL-6酶聯免疫吸附試驗試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號：88-7346、88-8350、88-7261、88-7066）；ICAM-1抗體（美國Proteintech 公司，貨號：10020-1-AP），p38 MAPK 抗體（美國CST 公司，貨號：3690），β-actin 抗體、MCP-1 抗體、HRP 標記羊抗鼠、羊抗兔IgG（美國Abcam 公司，貨號：ab9669、ab6276、ab6789、ab6721）；p38 MAPK 通路抑制劑SB203580（上海陶素公司，批號：152121-47-6）。

1.2.2 主要儀器 雙垂直電泳槽（品牌：CAVOY；型號：MP-8001）；轉移槽（品牌：CAVOY；型號：MP-3030）；溫控搖床（品牌：其林貝爾；型號：TS-2000A）；電泳儀（品牌：CAVOY；型號：PP-1150）；熒光定量PCR 儀（廠家：Bioer Technology；儀器型號：Line Gene 9600 Plus）。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清制備 SPF 級Wistar 雄性大鼠，體重290～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。實驗動物倫理號：BUCM-4-2021060901-2049。實驗動物飼養于北京中醫藥大學動物飼養室，室溫18～22℃，濕度40%～60%，自然光照，喂標準顆粒飼料，自由飲水，適應性飼養并觀察1 周，然后運用隨機數字表法將其分為兩組。一組予祛風通絡方47.2 g/（kg·d）灌胃，另一組灌服同體積的生理鹽水，2 次/d，連續3 d。末次灌胃2 h 后，麻醉后在大鼠股動脈進行無菌采血。將采集到的血液在4℃下靜置4 h，在3000 r/min（離心半徑8.5 cm）條件下離心20 min，分離血清，56℃水浴中滅活30 min，過濾除菌，-20℃保存。祛風通絡方（組成：牛蒡子、蠶砂、穿山龍）顆粒劑，由北京中醫藥大學東直門醫院藥劑科提供。

1.3.2 細胞培養及分組 將人腎小球系膜細胞接種于含有10%胎牛血清（FBS）的低糖DMEM 培養基中，存放于37℃、5%CO2培養箱中培養，之后分別對各組進行處理：正常組（低糖DMEM 培養液+正常大鼠血清）、模型組（高糖DMEM 培養液+正常大鼠血清）、抑制劑組（高糖DMEM 培養液+正常大鼠血清+5 μmol/L SB203580 預處理）、祛風通絡組（高糖DMEM 培養液+服用祛風通絡方的大鼠血清）。

1.4 檢測指標

1.4.1 酶聯免疫吸附試驗檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 的表達水平 取生長良好四組細胞，以5×105個/孔密度接種于6 孔板，培養24 h 后收集細胞上清液，依據IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 試劑盒說明書進行測定。每組6 個復孔。

1.4.2 Western blot 檢 測ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK 的表達水平 四組培養48 h 后收集并提取細胞蛋白，按常規方法進行電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，然后顯色、拍照。上述過程重復3 次。結果采用Quantity One v.4.6.2 軟件分析相對灰度值，并進行統計。

1.4.3 RT-PCR 檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK 的mRNA 表達水平 取生長良好四組細胞，培養48 h 后收集，提取RNA，用cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行反轉錄，按照說明依次加入各組分。引物由北京基譜生物科技有限公司提供，序列及長度見表1。將反應體系進行95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，共45 個循環，分別測定待測樣本目的基因及內參的Ct 值，按照2-ΔΔCt相對定量的計算公式，計算各組基因表達水平量的差異。

表1 引物序列及產物大小

1.5 統計學方法

采用SPSS 26.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平比較

模型組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平高于正常組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。祛風通絡組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 四組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平比較（pg/ml，，n=6）

表2 四組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平比較（pg/ml，，n=6）

注 與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。IL：白細胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；TGF-β1：轉化生長因子-β1

2.2 四組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 水平比較

模型組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 高于正常組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。祛風通絡組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖1、表3。

表3 四組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 水平比較（，n=3）

表3 四組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 水平比較（，n=3）

注 與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。p38 MAPK：p38 絲裂原活化蛋白激酶；ICAM-1：細胞間黏附分子-1；MCP-1：單核細胞趨化蛋白-1

2.3 四組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 的mRNA 表達水平比較

模型組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 的mRNA 表達水平高于正常組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。祛風通絡組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 的mRNA表達水平低于模型組，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。見圖2～3。

3 討論

本研究基于《黃帝內經》理論，對于DN 提出了“腎絡伏風”病機學說，認為消渴病日久，熱傷氣陰，久病及腎，腎絡虧虛，外風與內風乘虛侵襲人體，伏于腎之絡脈，形成“腎絡伏風”，治療當重視祛風通絡法，臨床常使用各類“風藥”，如牛蒡子、穿山龍、蠶砂等，取得了良好的效果[14-17]。

炎癥信號通路受復雜的網絡調控，p38 MAPK 是其中重要的調節機制之一，可使炎癥反應形成惡性循環。IL-1β、IL-6、TGF-β1 參與了腎小球系膜細胞的異常增殖和細胞外基質的過度沉積[18-21]，而TNF-α 與DN 的腎肥大及超濾密切相關，是造成DN 蛋白尿發生的重要因子之一[22]。MCP-1 是導致DN 慢性炎癥反應的重要原因之一，其可通過激活及趨化單核/巨噬細胞，釋放多種炎癥介質如IL-6、ICAM-1 等，刺激腎小球毛細血管基膜變厚、腎小球系膜細胞增殖及細胞外基質生成增多，從而加快腎小球的硬化[23-24]。在DN 中，高表達的ICAM-1 可促使單核細胞向腎臟游走，引發單核細胞、淋巴細胞與血管內皮細胞之間的黏附，使炎癥細胞在腎臟浸潤，產生細胞因子，加重內皮細胞損傷[25]。

本研究結果顯示，在高糖誘導后，人腎小球系膜細胞中的IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、ICAM-1 表達升高，p38 MAPK 信號通路激活。祛風通絡方含藥血清干預后，可明顯減輕高糖誘導的人腎小球系膜細胞的炎癥反應，并且可以抑制p38 MAPK 信號通路的激活，提示祛風通絡方可能通過抑制p38 MAPK 信號通路，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、ICAM-1 的表達，從而發揮抗炎作用。

綜上，本研究顯示祛風通絡方可以降低高糖誘導人腎小球系膜細胞的IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、ICAM-1 的表達，從而減輕炎癥反應，其機制與p38 MAPK 信號通路相關。