高通量測序解析驢骨膠原蛋白促進傷口愈合的潛在分子機制

廖 峰，樊雨梅，帖 航，趙海晴，蘇 寧,

（1.國家膠類中藥工程技術研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東聊城 252201；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

皮膚傷口愈合是一個復雜的過程，包括炎癥、增殖和重塑等一系列連續和重疊的病理生理過程。這一過程涉及多種細胞、細胞因子、生長因子和細胞外基質間的相互作用[1]。據統計，2013年全世界約有2000萬人受慢性傷口的困擾，且隨著人口老齡化的加重、肥胖和糖尿病等人群的不斷上升，遭受困擾的人群可能會繼續增加[2]。因此，尋找安全有效的促進傷口愈合的功效成分成為了研究熱點。現代研究表明，使用膠原蛋白等天然成分可有效改善傷口愈合過程。膠原蛋白發揮趨化作用，促進成纖維細胞黏附到傷口，并能有效促進成纖維細胞的增殖[3]。膠原蛋白還能激活巨噬細胞[4]，誘導細胞因子和生長因子的表達，促進傷口愈合過程中的血管生成[5]。此外，膠原蛋白還能促進傷口組織中膠原沉積和組織重塑[6]，進一步促進傷口愈合。據報道，牛骨膠原寡肽[7-8]、鹿茸膠原蛋白[9]、馬膠原蛋白[10]、魚皮膠原蛋白[11-13]、魚鱗膠原蛋白[14]和魚骨膠原蛋白[3]等均可有效促進傷口愈合。

膠原蛋白主要來源于豬、牛的皮和骨，漁業來源的膠原蛋白正在逐年增加。但因豬、牛來源的膠原蛋白存在瘋牛病、口蹄疫及宗教原因的風險，漁業來源的膠原蛋白尤其冷水魚膠原蛋白穩定差、流變性差[15]，限制了豬、牛以及漁業來源膠原蛋白的廣泛應用。馬和驢幾乎沒有人畜共患病[16-17]和報道的免疫反應[18]，使得馬和驢膠原蛋白的開發逐漸成為研究熱點。據Gallo等[19]報道，馬腱膠原材料具有抗炎、鎮痛、止血、刺激血管生成和成纖維細胞遷移的能力。但是，關于驢骨膠原蛋白促進傷口愈合的研究尚未報道。

因此，本研究擬通過驢骨膠原蛋白對成纖維細胞增殖、遷移以及I型膠原蛋白分泌量的影響，初步探究驢骨膠原蛋白促進傷口愈合的作用，并采用轉錄組學測序技術（RNA Sequencing，RNA-Seq）篩選驢骨膠原蛋白作用于成纖維細胞后的差異表達基因以及作用通路，揭示驢骨膠原蛋白促進傷口愈合的可能作用機制，以期為今后驢骨膠原蛋白的開發及應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

驢骨 山東天龍驢產業研究院；胎牛血清（FBS）、PBS、青霉素/鏈霉素、DMEM培養基 Gibco公司；CCK-8試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；BrdU試劑盒 Roche公司；人I型膠原蛋白ELISA試劑盒 Cusabio公司；人皮膚成纖維細胞（NHDFs）ATCC細胞庫；人成纖維細胞（FB細胞） 博溪生物科技有限公司。

MULTISKAN GO多功能酶標儀、371二氧化碳培養箱、NanoDrop 2000微量紫外分光光度計、ABI 7500熒光定量PCR儀 Thermos公司；2100 Bioanalyzer生物芯片分析系統 Agilent公司；JY600E電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 驢骨膠原蛋白的制備 驢骨→解凍清洗→破粒→高溫蒸煮提取（2倍純凈水，140 ℃，攪拌3 h）→出液→酶解（1倍純凈水，60 ℃加風味蛋白酶（酶活：1.52×104U/g）酶解 1 h→滅酶（140 ℃，1 h）→均質→濃縮→噴霧干燥→驢骨膠原蛋白粉[20]。

1.2.2 驢骨膠原蛋白促進傷口愈合效果的初步探究

1.2.2.1 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞存活率的影響實驗分為空白對照組、溶劑對照組、實驗組。空白對照組和實驗組將處于對數生長期的NHDFs細胞以密度 8×104/mL 接種于 96孔板，每孔 100 μL，空白對照組加入100 μL含10%胎牛血清的完全培養基，每組設3個平行復孔，培養24 h。實驗組分別加入 100 μL含不同濃度驢骨膠原蛋白（0.16、0.31、0.63、1.25、2.50和 5 g/mL）的 DMEM完全培養基。溶劑對照組和空白對照組分別加入100 μL完全培養基。在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養48 h后，用200 μL預溫的PBS清洗2次。去除清洗溶液，每孔準確加入100 μL CCK8工作液，于37 ℃、5% CO2培養箱培養1～3 h，在450 nm下測定吸光度。按照下式計算細胞存活率。

1.2.2.2 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞增殖的影響實驗分為溶劑對照組、實驗組，各組均需要同時設置對應的背景組，背景組與對應組的所有操作一致，只是不添加BrdU試劑，用以扣除BrdU的背景。實驗組將處于對數生長期的 NHDFs細胞以密度8×103個/mL，接種于 96 孔板，每孔 100 μL，常規培養（37 ℃，5% CO2）24 h。實驗組與其對應的背景組換上 100 μL 含不同濃度驢骨膠原蛋白（0、0.02、0.05、0.09、0.19、0.38、0.75和 1.5 g/mL）的 DMEM完全培養基。溶劑對照組及其對應的背景組分別加入100 μL完全培養基。加藥后在培養箱（37 ℃，5%CO2）中繼續培養48 h，然后按照BrdU試劑盒說明書要求進行操作。按照下面公式計算細胞增殖率。

1.2.2.3 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞遷移的影響收集對數生長期NHDFs細胞，按照細胞密度為8×105個/孔接種至6孔板，每孔含培養液2 mL。在培養箱（37 ℃，5% CO2）中培養 24 h后，使用無菌槍頭劃出劃痕，用PBS沖洗2次以去除劃痕區殘留細胞。劃痕后隨機分為陽性對照組、空白對照組和實驗組，每組設置3個平行。陽性對照組加入含2%胎牛血清的培養基，空白對照組加入不含胎牛血清的培養基，實驗組加入驢骨膠原蛋白濃度為1.5 g/mL的不含胎牛血清的培養基。加藥后在培養箱（37 ℃，5% CO2）中繼續培養6 h后，于倒置顯微鏡下觀察劃痕區細胞的愈合情況并照相記錄，使用Image-Pro Plus 6.0計算劃痕區面積的平均值，按照下面公式計算劃痕區遷移率。

1.2.2.4 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞Col I蛋白表達的影響 將NHDFs細胞以5×105個/mL接種至24 孔板，在培養箱（37 ℃，5% CO2）中培養 24 h 后，將生長接近融合的細胞進行同步化處理，即換用無血清DMEM培養基饑餓2 h。隨機分為陽性對照組、空白對照組和實驗組，每組設置3個平行。陽性對照組加入含15 μmol/L的抗壞血酸（VC）的培養基，實驗組加入驢骨膠原蛋白濃度為1.5 g/mL的培養基，空白對照組加入等體積的培養基。加藥后繼續培養48 h，收集細胞培養上清液備用。按照膠原蛋白ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀測定波長450 nm處的吸光值，根據繪制的標準曲線計算NHDFs細胞外基質中膠原蛋白含量。

1.2.3 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞功能的初步探究

1.2.3.1 RNA-Seq檢測差異表達的基因 將成纖維細胞以4×105個/mL接種至6孔板中， 37 ℃，5% CO2中孵育過夜。實驗組加入含驢骨膠原蛋白的培養基，空白對照組加入等體積的培養基。繼續培養24 h后，棄掉培養液，用PBS洗滌細胞3次。向細胞中加入1 mL Trizol，待融化成液體后轉入Ep管中，收樣備用。Trizol法提取模型總RNA，并進行質檢。RNA樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。隨后加入適量打斷試劑將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板合成cDNA。經過磁珠純化、末端修復、加堿基A尾并連接測序接頭，然后進行PCR富集得到最終的cDNA文庫。用Agilent 2100 Bioanalyzer生物芯片分析系統和ABI 7500熒光定量PCR儀進行質量和產量檢測。文庫質控合格后，用Illumina HiSeqTM 2000進行測序，使用統計學方法對有效數據進行分析。

1.2.3.2 差異表達基因的基因本體論及通路分析采用clusterProfiler軟件對差異基因集進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。比較處理組與空白對照組的RNAseq有效數據，差異倍數≥1且P＜0.05視為差異表達基因。對于篩選的基因用基因本體論數據庫（Gene Ontology）和注釋、可視化和整合發現數據庫（DAVID）進行GO和KEGG分析。用P值反應信號通路差異的顯著性。

1.3 數據處理

應用SPSS26.0統計軟件進行數據分析，實驗重復3次，數據結果以“均數士標準差”（±SD）表示。多組數據差異比較采用方差分析，兩組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。*表示與空白對照組相比，P＜0.05；**表示與空白對照組相比，P＜0.01；#表示與陽性對照組相比，P＜0.05；##表示與陽性對照組相比，P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 驢骨膠原蛋白促進傷口愈合效果的初步探究

2.1.1 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞存活率的影響用CCK-8檢測驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞的毒性，結果顯示（圖1），驢骨膠原蛋白在濃度為0.16～5 g/mL對NHDFs細胞無毒性作用，甚至顯示出一定的促進細胞生長的作用，細胞存活率可以提高18.14%～55.78%。

圖1 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞存活率的影響Fig.1 Effects of donkey bone collagen on the survival rate of NHDFs cells

2.1.2 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞增殖的影響采用BrdU法研究驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞增殖的影響，結果見圖2。不同濃度的驢骨膠原蛋白作用NHDFs細胞24 h后，與空白對照組相比，在驢骨膠原蛋白濃度為0.75、1.50 g/mL時，驢骨膠原蛋白具有顯著的促進NHDFs細胞增殖的作用（P＜0.05），細胞增殖率分別為131.25%、169.30%。因此，后續選擇濃度1.5 g/mL進行下一階段實驗。此外，驢骨膠原蛋白濃度在0.75～1.50 g/mL內，能夠促進NHDFs細胞增殖，且驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞增殖的影響呈現劑量依賴關系。

圖2 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞增殖的影響Fig.2 Effects of donkey bone collagen on the proliferation of NHDFs cells

2.1.3 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞遷移的影響采用細胞體外劃痕實驗，利用Image pro plus軟件計算，比較0和6 h劃痕面積的變化，探討不同濃度驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞遷移能力的影響，結果見圖3。結果顯示，與空白對照組相比，2%胎牛血清作用后，NHDFs細胞遷移率增加6.26%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與劉磊等[21]報道的胎牛血清對成纖維細胞遷移率影響的效果一致，表明實驗體系構建成功。與空白對照組相比，1.50 g/mL的驢骨膠原蛋白能顯著增加 NHDFs細胞遷移率（P＜0.05），且與2%胎牛血清促進NHDFs細胞遷移的效果差異不具有統計學意義（P＞0.05）。與狹鱈魚皮膠原蛋白肽作用后成纖維細胞遷移率的提高效果一致[22]。可見，驢骨膠原蛋白能夠顯著促進NHDFs細胞的遷移融合，具有促進傷口愈合效果。

圖3 各處理組對HaCaT細胞遷移的影響Fig.3 Effects of different treatments on the migration of HaCaT cells

2.1.4 驢骨膠原蛋白對膠原蛋白合成的影響 I型膠原蛋白（Collagen I，Col I）作為細胞組織間質的重要組成成分，在傷口愈合過程中發揮著重要的作用。據報道，狹鱈魚皮膠原蛋白肽[22]、羅非魚皮Ⅰ型酶溶性膠原蛋白[23]均能促進Col I的表達，有效控制傷口愈合過程。采用ELISA法檢測驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞外基質中的膠原蛋白的影響，結果見圖4。因抗壞血酸在促進創面愈合和調節膠原蛋白生成中起重要作用[24]，選擇抗壞血酸作為陽性對照。結果顯示，濃度為15 μmol/L的抗壞血酸（VC）能夠明顯促進Col I的表達（P＜0.01）。與空白對照組相比，1.50 g/mL的驢骨膠原蛋白也能極顯著促進Col I的表達（P＜0.01），但效果弱于15 μmol/L的抗壞血酸，Col I含量相差18.99 ng/mL，差異具有統計學意義（P＜0.01）。說明1.50 g/mL的驢骨膠原蛋白能夠促進Col I含量增加，但效果弱于15 μmol/L的抗壞血酸。

圖4 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞Col I含量的影響Fig.4 Effect of donkey bone collagen on the content of Col I in NHDFs

2.2 驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞功能的初步探究

2.2.1 驢骨膠原蛋白作用NHDFs細胞后主要差異表達基因 差異基因統計分析結果顯示，與空白對照組相比，驢骨膠原蛋白作用NHDFs細胞后，差異表達基因火山圖見圖5，其中每一個點代表一個基因，藍色點表示表達下調的基因，紅色點表示表達上調的基因。基于P＜0.05 且|-Log2（Fold change）|＞1 篩選標準，共獲得差異表達基因384個，其中上調基因172個，下調基因212個。

圖5 差異表達基因火山圖Fig.5 Volcanic map of differentially expressed genes

2.2.2 差異表達基因GO富集分析 為初步明確驢骨膠原蛋白在成纖維細胞中發揮的具體生物學功能，分別對已鑒定出的384個差異表達基因進行了GO富集分析。通過GO富集分析可將差異表達的基因按功能分為：生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三類。GO功能富集結果顯示（見圖6），與空白對照組相比，驢骨膠原蛋白作用成纖維細胞后，差異表達基因參與的生物過程主要有中性粒細胞趨化性（neutrophil chemotaxis）、中性粒細胞遷移（neutrophil migration）、粒細胞趨化性（granulocyte chemotaxis），富集的分子功能主要包括細胞因子活性（cytokine activity）、趨化因子活性（chemokine activity）、受體配體活性（receptor ligand activity）、趨化因子受體結合（chemokine receptor binding）、G蛋白偶聯受體結合（G protein-coupled receptor binding）、細胞因子受體結合（cytokine receptor binding），差異基因在細胞組分條目下的富集分析沒有意義（經多重假設檢驗校正方法校正后的P值＞0.05）。從GO富集結果推測，驢骨膠原蛋白參與成纖維細胞的免疫反應的調控。研究表明，與正常皮膚成纖維細胞相比，慢性病人傷口成纖維細胞的五種趨化因子CXCL（CXC chemokine ligand，CXC 趨化因子配體；CXCL-1、-2、-3、-5 和-6）基因表達降低兩倍[25]。驢骨膠原蛋白作用于成纖維細胞的GO富集結果顯示，CXCL-3、CXCL-5、CXCL-6三種趨化因子上調，據此推測驢骨膠原蛋白可能通過調控CXCL趨化因子發揮促進傷口愈合的作用。

圖6 差異表達基因的GO功能富集分析Fig.6 GO annotation of the differentially expressed genes

2.2.3 差異表達基因KEGG富集分析 為進一步研究驢骨膠原蛋白作用成纖維細胞后差異表達基因參與的代謝通路，對所有差異基因進行了KEGG富集分析。圖7為驢骨膠原蛋白作用于成纖維細胞涉及的信號通路的氣泡圖。結果顯示，差異基因參與的信號通路包括類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis）、細胞因子-細胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、化學致癌（Chemical carcinogenesis）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用（Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）和 TNF 信號通路（TNF signaling pathway）。

圖7 差異表達基因的KEGG通路富集分析Fig.7 Enrichment analysis of KEGG pathway of the differentially expressed genes

在皮膚損傷中，IL-17的主要來源于巨噬細胞，在傷口愈合的早期炎癥階段發揮作用[26]。有研究表明，IL-17A能夠誘導促炎細胞因子的表達，包括CCL2（CC 趨化因子配體 2）、CXCL8、IL-Iβ和 IL-6[27-28]，這些細胞因子都與傷口愈合有關。缺乏IL-17可增強和加速皮膚組織的修復[29]。TNF蛋白超家族的典型成員TNF-α在炎癥和隨后的傷口愈合中起著關鍵作用[30]，TNF-α信號傳導介導炎癥分子的產生，調節細胞存活、增殖和死亡，并影響上皮傷口愈合。此外，TNF-α信號傳導還可介導上皮遷移，增強上皮細胞的存活和增殖，從而促進傷口愈合[31]。Wang等[32]報道，在傷口愈合過程中，炎性巨噬細胞（Ly6C+）分泌的細胞因子能夠激活TNF和IL-17信號通路，TGF-β、HIF-1、NF-κB 和 Rap1信號通路與中性粒細胞分泌的細胞因子高度相關。因此，驢骨膠原蛋白促進成纖維細胞傷口愈合的機制與驢骨膠原蛋白刺激炎性巨噬細胞分泌細胞因子密切相關。KEGG通路富集結果顯示，IL-17和TNF信號通路中的IL-1β、IL-32、CXCL3、CXCL5、CXCL6等基因在驢骨膠原蛋白作用于成纖維細胞中表達有顯著差異，說明這些因子可能參與了驢骨膠原蛋白促進傷口愈合的過程，為進一步研究驢骨膠原蛋白促進傷口的分子機制奠定了基礎。

3 結論

本研究通過研究驢骨膠原蛋白對成纖維細胞增殖、遷移以及Col I分泌量的影響，初步探究驢骨膠原蛋白促進傷口愈合的效果。研究發現，驢骨膠原蛋白對NHDFs細胞沒有毒性，且在濃度0.16～5.0 g/mL時使NHDFs細胞存活率提高18.14%～55.78%。驢骨膠原蛋白濃度在0.75～1.50 g/mL內對NHDFs細胞增殖的影響呈現劑量依賴關系。另外，1.50 g/mL的驢骨膠原蛋白能明顯增加NHDFs細胞遷移率和促進Col I的表達。

采用轉錄組學技術篩選驢骨膠原蛋白作用于成纖維細胞后的差異表達基因，以揭示驢骨膠原蛋白對成纖維細胞可能的作用途徑，為進一步研究驢骨膠蛋白促進皮膚傷口愈合的具體分子機制提供思路。結果表明，驢骨膠原蛋白作用NHDFs細胞后，共獲得差異表達基因384個。GO功能富集結果顯示，驢骨膠原蛋白參與的生物學過程主要有中性粒細胞趨化性、中性粒細胞遷移、粒細胞趨化性，參與的分子功能主要包括細胞因子活性、趨化因子活性、受體配體活性、趨化因子受體結合等。KEGG富集分析表明，驢骨膠原蛋白參與成纖維細胞的信號通路包括IL-17信號通路和TNF信號通路。推測，驢骨膠原蛋白可能通過IL-17和TNF-α介導CXCL趨化因子發揮促進皮膚傷口愈合的作用，后需進一步分子實驗來探究驢骨膠原蛋白促進傷口愈合的具體分子機制。