新型可降解編織結構神經再生導管的制備及其性能

姚若彤， 趙婧媛， 閆一欣， 段立蓉， 王 恬，嚴 佳， 張淑軍， 李 剛,2

(1. 蘇州大學 紡織與服裝工程學院， 江蘇 蘇州 215123； 2. 蘇州大學 現代絲綢國家工程實驗室， 江蘇 蘇州 215123； 3. 北卡羅萊納州立大學 紡織學院， 羅利 27695)

周圍神經損傷在臨床病癥中十分常見，占據了所有外科創傷病例的2%～5%[1]。自然災害或意外事故都會對人體周圍神經造成不同程度的損傷，從而導致創傷性或非創傷性疾病、感覺不良，甚至是癱瘓[2]。當周圍神經的缺損距離較短(小于5 mm)時，可以直接通過手術縫合的方式進行修復，但對于長距離(缺損距離大于受損神經直徑4倍以上或者缺損長度大于3 cm)的神經損傷，直接縫合會使得縫合線處的張力較大，導致手術效果不理想[3]。對此，臨床上常使用的治療方案是自體移植和異體移植，自體神經移植是修復周圍神經受損的“金標準”[4]，但其也因供體不足、供區功能受損以及神經瘤的形成而具有一定的局限性[5]，異體移植可能會產生免疫排斥反應和交叉感染等問題[6]。基于此，人工神經移植成為治療周圍神經損傷的熱點研究方向。

神經導管需具備良好的力學性能、生物相容性和一定的引導性，目前針對神經導管性能的改善工作主要從材料選擇和結構設計兩方面進行[7]。常用的材料主要有生物降解材料、非生物降解材料和生物衍生材料[8]，其中生物降解材料來源廣泛，具有優異的生物相容性和可降解性能，是植入體內的首選材料之一[9]。蠶絲理化性質優良，同時具有良好的力學性能和生物相容性[10]，絲素蛋白約占蠶絲總質量的80%[11-12]，以絲素蛋白為原料制作的神經導管在體內炎癥反應低且可進行生物降解，能夠有效促進受損神經的功能恢復[13]；殼聚糖具有抗菌和抑制炎癥反應的作用[14]。鎂元素作為人體內必不可少的微量元素，在適宜的微環境下能夠促進雪旺氏細胞的增殖，如分泌生長因子和細胞外基質等，從而改善周圍神經缺損的修復[15]。靜電紡納米纖維與細胞外基質具有相似結構，為細胞的黏附與增殖提供仿生微環境，同時可負載藥物用于在受損部位構建藥物釋放系統[16-17]，但純納米纖維結構不穩定，且中空結構的導管缺乏對軸突再生的結構性支撐。

本文將傳統編織技術、靜電紡絲和冷凍干燥技術相結合，軸紗與編織紗緊密交織形成穩定的編織結構，起到力學支撐的作用，而導管內腔的海綿層結構為軸突生長提供了物理引導，同時為細胞的黏附和增殖提供穩定空間。以絲素蛋白溶液、蠶絲紗、殼聚糖和氧化鎂為原料制備了一種含有殼聚糖涂層-編織層-納米纖維海綿層的3層復合結構的神經導管支架，并對其外觀形貌進行表征，討論了導管軸紗、內外層結構對力學性能的影響，同時研究了導管在體外實驗條件下的離子緩釋性能和細胞相容性。

1 實驗部分

1.1 材料與設備

生絲(4A級)，桑蠶絲線(5、9 tex)，嵊州市協和絲綢有限公司；殼聚糖(BR脫乙酰度95%)，國藥集團化學試劑有限公司；納米氧化鎂粉體(粒徑20 nm，純度98%)，江蘇先豐納米材料科技有限公司；鎂離子標準溶液(100 μg/mL)，上海麥克林生化科技有限公司；無水碳酸鈉(AR)、聚乙二醇，上海國藥集團化學試劑有限公司；溴化鋰(AR)，上海阿拉丁試劑有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH值為7.4)，美國Hyclone公司；胎牛血清，美國Gibco公司；高糖培養基(DMEM)，美國Gibco公司；1%鏈霉素-青霉素，美國Gibco公司；CCK-8細胞計數試劑盒(1 000 U)，蘇州碧云天生物技術。

SFJ-Y-C32型立式錠子編織機，上海哈考線帶設備有限公司；TL-Pro-BM型靜電紡絲機，深圳通力微納有限公司；ALPHA 2-4 LSC型冷凍干燥機，德國Christ公司；TMS-PRO型質構儀，美國FTC；5967萬能材料試驗機，美國英斯特朗公司；S-4800型冷場發射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；TM3030型能譜儀，日本日立公司；Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀，美國尼高利科學儀器技術公司；AA240FS-GTA120型原子吸收光譜儀，美國瓦里安公司；酶聯免疫檢驗儀6500，美國Wisdom公司。

1.2 神經導管制備

1.2.1 絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜的制備

將30 g生絲與一定量的無水碳酸鈉放入沸水中煮沸30 min，進行脫膠處理，沖洗2～3次后放置在通風處進行干燥[18]。將干燥后的脫膠蠶絲溶解于濃度為9.3 mol/L的100 mL溴化鋰溶液中，在60 ℃ 的恒溫箱中靜置4 h，得到淡黃色透明的絲素蛋白溶液[19]。將溶液裝入透析袋，放入去離子水中透析36 h，隨后再次放入15%的聚乙二醇溶液中，將其置于磁力攪拌器上不斷攪拌，48 h后絲素蛋白的含量上升為24%～28%[20]。配置一定濃度梯度的鎂離子溶液，質量濃度分別為0、0.01、0.015和0.02 g/mL，將其與一定量的絲素蛋白溶液均勻混合，得到絲素含量為24%的絲素蛋白/鎂離子溶液。利用靜電紡絲技術，在20 kV電壓下，保持針頭與接收器之間的距離為25 cm，紡絲推速為0.2 mL/h，制備纖維膜結構完整均勻的絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜[21]。

1.2.2 編織結構層的設計

采用立式錠子編織機，分別以5和9 tex的桑蠶絲線為軸紗和編織紗，制備內徑為2 mm的三維管狀編織物[9]，作為導管的中間層結構。為討論編織層中軸紗對導管性能的影響，實驗同時設置無軸紗編織層作為對照組。

1.2.3 殼聚糖涂層的制備

將質量分數為6%的殼聚糖溶液涂覆于編織層外層上，經烘箱干燥后形成殼聚糖涂層。殼聚糖降解過程中生成殼寡糖，起到抑制炎癥反應和細胞感染的作用[22]。

1.2.4 海綿結構層的制備

將1.2.1中制備的絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜經乙醇處理后裁剪成細小的短纖維，均勻分散于6%的殼聚糖溶液中，利用注射器將混合溶液注入導管內腔，放入-80 ℃的低溫冰箱中冷凍2 d，利用真空干燥機冷凍干燥3 d，得到含納米纖維的海綿層結構。

1.2.5 神經導管結構設計

為探究軸紗和內外層結構對神經導管力學性能的影響，本文以這2種要素為變量，通過設置不同的排列組合方式，制備4種結構的神經導管，如表1所示。通過對相應測試結果進行分析，找到最優化的材料組合比例和結構設計方案。

表1 神經導管的制備參數

1.3 結構與性能測試

1.3.1 形貌觀察

采用掃描電子顯微鏡對4個濃度梯度的絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜的形貌進行觀察，利用Image-J 軟件分別在每個樣品中選取100根纖維進行直徑測量，經數據處理后分析其分布情況。同時，對制備的神經導管進行橫向切片處理，利用掃描電子顯微鏡分別對含/不含海綿層的導管截面及管壁進行觀察，利用Image-J軟件測量每個海綿層中的100個孔徑直徑，繪制孔徑分布圖，對海綿層中的孔徑直徑大小和分布情況進行測試分析。

1.3.2 化學結構測試

以經過乙醇處理的絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜和未經處理的納米纖維膜為樣品，利用傅里葉紅外光譜儀進行測試，波數范圍為4 000～400 cm-1，對得到的數據進行處理，繪制出紅外光譜圖。

1.3.3 試樣表面元素含量測試

分別在4種濃度梯度的絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜上取樣，使用能譜儀分析每個樣品中的C、O、Mg 3種元素的含量，得到數據匯總成表格。

1.3.4 力學性能測試

取長度為5 cm的4組不同結構的導管作為樣品，每組設置3個平行樣。利用TMS-PRO型質構儀檢測導管的軸向壓縮性能，壓縮位移為導管直徑的50%，壓縮速度為15 mm/min，測試徑向所能承受的最大擠壓力，取平均值±標準誤差并繪制數據圖；拉伸性能測試在萬能材料試驗機上進行，夾持距離為20 mm，加載速度為100 mm/min，拉伸樣品直至軸紗斷裂，繪制應力-應變曲線圖[23]。

1.3.5 鎂離子緩釋性能測試

分別將含有不同鎂離子質量濃度的導管樣品浸入10 mL、pH值為7.4的PBS溶液中，放置于37 ℃恒溫箱，培養至固定時間(1、3、7、14、28 d) 后取出1 mL 培養液，同時配置標準溶液，利用原子吸收光譜儀檢測溶液吸光度，根據標準曲線確定鎂離子質量濃度，做出鎂離子質量濃度-時間關系曲線圖。

1.3.6 細胞實驗

細胞實驗材料采用大鼠神經雪旺氏細胞，培養基的組成成分為89%的DMEM，10%的胎牛血清和1%的鏈霉素-青霉素雙抗。將直接培養在24孔細胞培養板中的細胞作為對照組，實驗組則將細胞分別培養在鎂離子質量濃度為0、0.01和0.02 g/mL的神經導管中。將大鼠神經雪旺氏細胞復蘇后，放入5%二氧化碳的培養箱中進行增殖，同時將導管樣品切成5 mm，輻照滅菌處理。接種細胞后，將樣品放入完全培養基中繼續培養[24]。在第1、3、5、7 d后取出對照組和實驗組，更換新的24孔板。每孔放入1個樣品并加入100 μL含有CCK-8試劑的培養基，利用酶聯免疫檢驗儀測其在450 nm處的吸光度，根據吸光度值估計細胞數量。

2 結果與討論

2.1 絲素蛋白/鎂離子納米纖維膜微觀結構

2.1.1 表觀形貌分析

利用靜電紡絲技術紡制的納米纖維膜具有較大的比表面積，可很好地模擬細胞外環境，有助于神經細胞黏附、增殖，從而促進受損神經再生。圖1示出納米纖維的形貌及其直徑分布。可知在電鏡觀測下，含有不同質量濃度納米級別氧化鎂粉、質量分數為24%的絲素蛋白溶液均成功制備出了靜電紡絲薄膜。其中加入了0.02 g/mL氧化鎂所紡得的靜電紡絲纖維的均勻度及細度(0.6～0.9 μm)最好，加入了0.01 g/mL氧化鎂所紡得的靜電紡絲纖維的均勻度較好，但直徑(1.5～2 μm)較大，未加入納米氧化鎂和加入0.015 g/mL的氧化鎂所得到的靜電紡絲纖維的均勻度較好，細度分布主要集中于1～1.5 μm 和0.8～1.4 μm。

圖1 靜電紡納米纖維的形貌及其直徑分布

2.1.2 元素含量分析

表2示出靜電紡絲膜中C、O、Mg 3種元素的含量。可以看出，4組不同鎂離子質量濃度的靜電紡絲薄膜中均含有微量鎂元素。其中0 g/mL實驗組中本不應出現鎂元素，但結果中出現了質量分數為0.010%的鎂元素，原因可能來自于選樣檢測時導致的微量殘留，但由于其含量極少，可忽略不計。可以發現，鎂元素在幾種鎂離子質量濃度的靜電紡絲膜中分布不均，其原因是配置好的氧化鎂溶液在加入具有黏度的絲素蛋白溶液中時，即使通過攪拌等方式使其混合均勻，仍存在著分布不均的情況。

表2 含不同質量濃度鎂離子的靜電紡絲薄膜的元素含量

2.1.3 化學結構分析

固體狀態下，絲素蛋白具有Silk Ⅰ和Silk Ⅱ 2種構型，其中：Silk Ⅰ構型主要是無規卷曲結構，多在非結晶區；Silk Ⅱ構型主要是β折疊的層狀結構。表3示出絲素蛋白的主要吸收峰[24]。

表3 絲素蛋白的紅外光譜特征峰[24]

圖2示出靜電紡絲薄膜的紅外光譜測試結果。由圖可得，未經乙醇處理的絲素蛋白膜的酰胺 Ⅰ和酰胺 Ⅱ結構的特征峰位于1 655、1 541 cm-1處，表明其中絲素蛋白的主要結構為Silk Ⅰ。經過無水乙醇處理的絲素蛋白膜中，酰胺 Ⅰ和酰胺 Ⅱ的特征峰向低波數方向偏移，且峰形變寬，表明經乙醇處理后，絲素蛋白中的結晶結構從不穩定的Silk Ⅰ 轉變成了穩定的Silk Ⅱ。這種結構的轉變改變了絲素蛋白的降解性能，增強了絲素蛋白膜的結構穩定性。在制備導管海綿層結構時，經乙醇處理的納米纖維膜在殼聚糖溶液中不易溶解破壞，從而在一定程度上改善了導管的力學性能。

圖2 靜電紡絲薄膜的紅外光譜圖

2.2 神經導管的形貌結構分析

通過三向帶芯編織技術得到的編織層為內徑2 mm 的中空管狀結構，如圖3所示。其管壁清晰可見，編織紗和軸紗相互緊密交織形成編織結構，編織結構的主要作用是為復合神經導管結構提供力學支撐，主要增強其軸向拉伸性能[25]。殼聚糖和靜電紡絲納米短纖維混合溶液注入編織層內部后，經過冷凍干燥形成納米纖維海綿層結構，該結構可極大增強神經導管的徑向壓縮性能。冷凍干燥后的納米纖維海綿層表面粗糙，多孔且相互連通。

圖3 復合編織結構神經導管的掃描電鏡照片

納米纖維海綿層中孔徑分布較為均勻，且主要集中在0.04～0.08 mm之間，有利于神經細胞黏附與增殖且使神經導管具有一定的滲透性，有助于受損神經部位同周圍的組織環境進行水、氧氣和營養物質的交換[26]見圖4所示。

圖4 復合編織結構神經導管中納米纖維海綿層中的孔徑分布

2.3 神經導管的力學性能分析

為研究編織結構中軸紗以及納米纖維海綿層的力學作用，使用TMS-PRO質構儀對4組神經導管樣品在形變50%下的徑向壓縮性能進行測量，結果如圖5所示。可知，編織結構中有軸紗的神經導管相對于無軸紗的神經導管來說，徑向壓縮性能更好。具有納米纖維海綿層結構的神經導管其徑向壓縮性能比無納米纖維海綿層結構的更好。同時，以海綿層為變量的2組神經導管其徑向壓縮性能存在顯著差異，而改變軸紗并不會對壓縮性能產生顯著影響，由此可以說明，相較于軸紗，導管的納米纖維海綿層結構是影響導管壓縮性能的主要因素。有軸紗有納米纖維海綿層的神經導管的徑向壓縮性能大約為無軸紗無納米纖維海綿層的4倍，前者為1.3 N，后者為0.3 N，該結論為制備力學性能良好的復合結構的神經導管提供了依據。當研究神經導管的軸向拉伸性能時，以納米纖維海綿層為變量，可以發現，有納米海綿層的2組比相應的無納米纖維層的2組的拉伸性能更優異(見圖5(b))。但以有無軸紗為變量時，無軸紗的2組神經導管明顯比有軸紗的2組神經導管的拉伸性能更好，原因是在拉伸過程中，測試有軸紗的神經導管組的拉伸性能時直致軸紗斷裂，而無軸紗的神經導管組則到編織結構被破壞。

圖5 神經導管的力學性能

2.4 鎂離子的緩釋性能分析

鎂離子的緩釋速率會影響神經導管在體內的工作時間和效果。神經導管放入人體后，納米纖維海綿層中的鎂離子會緩慢釋放，從而起到促進神經中蛋白質的合成和神經細胞再生的作用。圖6示出鎂離子的緩釋曲線，顯示了第1、3、7、14、28 d鎂離子的累計釋放濃度。從整體來看，鎂離子緩釋濃度與樣品中所含藥物濃度成正相關，導管中的鎂離子質量濃度越高，在相同時間內釋放到環境中的鎂離子含量就越大。數據表明，當導管中鎂離子的質量濃度為0.01、0.015和0.02 g/mL時，導管能在培養基中緩慢釋放鎂離子28 d，釋放出的質量濃度水平保持在0.8～1.25 g/mL之間，不超過人體內鎂離子含量極限值，所以是安全的。

圖6 神經導管內鎂離子的緩釋曲線

2.5 神經導管的細胞相容性分析

圖7示出神經導管與細胞共培養第1、3、5、7 d的實驗結果。吸光度值可間接反映導管樣品中細胞的數量。圖中數據表明，3個實驗組(鎂離子質量濃度分別為0、0.01、0.02 g/mL)中細胞的增殖情況相似。從第1～3 d，細胞大量增殖，之后增速放緩，細胞數量保持穩定。其中含鎂離子導管樣品中細胞的增殖速度大于不含鎂離子的導管樣品。細胞逐漸在導管中充滿，之后從導管的兩端進入培養液中，這種情況可能導致細胞的增長速度保持不變甚至下降。在相同觀測時間內，含有鎂離子的樣品中細胞數量大于對照組，表明了在導管內加入鎂離子能夠促進細胞增殖，且隨著培養時間的延長，鎂離子對細胞增殖的促進效果越明顯。鎂離子濃度也會對細胞增殖產生一定的影響，當鎂離子質量濃度為0.01～0.02 g/mL 時，隨著濃度的提高，導管樣品中的細胞數量有所增加，表明在這一濃度范圍內，鎂離子質量濃度與細胞數量成正相關。實驗結果同時證明了該神經導管對細胞無明顯毒性，安全有效，具有良好的生物相容性。

圖7 CCK-8細胞增殖圖

3 結 論

本文利用編織技術、靜電紡絲和冷凍干燥制備三層結構的神經導管，通過形貌分析和力學性能表征，得到以下結論。

1)軸紗和海綿層結構能夠改善導管的抗壓縮能力，使導管具有優異的力學性能。其中海綿層表面粗糙，孔徑大小均勻，孔與孔之間相互連通，利于細胞黏附和環境中物質的內外交換。

2)神經導管內鎂離子能夠在體外微環境下長效穩定釋放，且當鎂離子質量濃度為0.02 g/mL時，其對細胞增殖的促進效果更明顯。