紅豆杉多糖對D-半乳糖致衰老小鼠模型肝功能的影響

李露露 徐素美

衰老是機體細胞、組織的機能和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的退行性變化，是生命發(fā)展的必然規(guī)律［1-2］，與高血壓、2型糖尿病、動脈粥樣硬化以及老年癡呆等許多疾病互為因果［3］。隨著人口老齡化加劇，至2050年全球60歲以上的老年人口數(shù)將占據(jù)人口總數(shù)的22%［4］。D-半乳糖被廣泛用于衰老模型的構(gòu)建［5］，高劑量D-半乳糖氧化可產(chǎn)生過氧化氫和醛糖，可進一步形成自由基和超氧陰離子加速細胞凋亡［6-7］，使機體出現(xiàn)多種功能減退等現(xiàn)象。多糖抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等作用的機制未完全闡明［8］。本研究旨在觀察紅豆杉多糖對D-半乳糖所造的衰老模型小鼠肝功能的影響，并初步探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 90只雄性SPF級ICR小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由南京大學模式實驗動物研究所提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（蘇）2015-0001。每籠4只分籠飼養(yǎng)，室溫（24±2）℃，濕度50%～70%，光暗周期12 h/12 h，自由飲食飲水。

1.2 儀器及試劑 渦旋混合器（型號：WH-861，華利達實驗設(shè)備有限公司），超聲細胞粉碎機（型號：JYD-650，上海之信儀器），全自動生化儀（型號：AU480），低速離心機（型號：X12R，德國貝克曼公司），SpectraMax Plus384多功能酶標儀（美國MD公司），自動包埋機（型號：EC-350-1，德國MICROM有限公司），石蠟切片機（型號：HM 315，德國MICROM有限公司）。D-半乳糖（國藥集團化學試劑有限公司），紅豆杉多糖（紅豆多糖含量：92.88%，分子量：59.2 Ku，單糖組成：甘露糖：葡萄糖：阿拉伯糖：半乳糖：鼠李糖=1∶1∶6∶4∶4，浙江省中醫(yī)藥研究院），多烯磷脂酰膽堿膠囊（易善復(fù)，賽諾菲制藥有限公司），丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒（WST-1法）（南京建成生物工程研究所），總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）（上海億日科技有限公司）。

1.3 實驗方法 （1）分組：ICR小鼠根據(jù)SPSS 21.0提供的隨機數(shù)字分為6組，空白組、D-半乳糖模型組、陽性藥物組（易善復(fù)）、紅豆杉多糖低劑量組（200 mg·kg-1）、紅豆杉多糖中劑量組（400 mg·kg-1）、紅豆杉多糖高劑量組（800 mg·kg-1）組。（2）造模：除空白對照組，其余各組均給予頸部皮下注射D-半乳糖100 mg·kg-1，共8周。（3）干預(yù)：造模第4周起，空白對照組及D-半乳糖模型組分別給予NS 10 mL·kg-1灌胃，1次/天，連續(xù)4周；紅豆杉多糖高/中/低劑量組分別給予由生理鹽水配置的20 mg·mL-1、40 mg·mL-1、80 mg·mL-1紅豆杉多糖水溶液灌胃10 mL·kg-1，1次/天，連續(xù)4周。（4）血清ALT、AST含量檢測：造模第8周結(jié)束時，利用全自動生化儀檢測小鼠血清AST、ALT水平。（5）肝組織勻漿中SOD活性、MDA含量、T-AOC測定：隨機挑選10只小鼠，準確稱取肝組織重量，按照肝組織重量（g）與NS體積（mL）為1∶9的比例加相應(yīng)體積的NS，剪碎組織，冰水浴，肝組織勻漿經(jīng)3,000 r/min離心10 min，取上清液，制備得到10%肝組織勻漿。利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠肝組織勻漿總抗氧化能力（T-AOC）。比色法檢測SOD活性及MDA含量。（6）小鼠肝臟HE染色：每組隨機挑選5只小鼠，水合氯醛麻醉后，開胸暴露心臟，5%福爾馬林灌注，取肝組織，放置4%多聚甲醛溶液中固定，按照濃度梯度進行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，切片脫蠟至水，HE染色后觀察肝組織變化。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)8周后各組小鼠的一般情況 空白組小鼠皮膚較緊實，活動能力可；D-半乳糖模型組小鼠皮膚比較松弛，易激惹，活動度差；紅豆杉多糖低/中/高劑量組和陽性藥物組小鼠的精神狀態(tài)可，皮膚松弛程度較模型組程度輕，活動度良好。

2.2 各組小鼠血清ALT、AST水平比較 與空白對照組比較，D-半乳糖模型組小鼠血清ALT、AST含量顯著升高（P<0.01）。與D-半乳糖模型組比較，紅豆杉多糖低/中/高劑量組及陽性藥物組小鼠血清ALT、AST含量均顯著降低（P<0.01）。肝功能改善程度與紅豆杉多糖劑量無明顯相關(guān)性。見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較 ［n=15，（±s）］

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較 ［n=15，（±s）］

注：與空白對照組比較，△P<0.01；與D-半乳糖模型組比較，*P<0.01

組別 ALT（U·L-1） AST（U·L-1）空白對照組 30.50±6.63 38.50±6.21 D-半乳糖模型組 41.00±16.67△ 81.57±17.18△陽性藥物組 21.29±7.87* 53.86±21.64*紅豆杉多糖低劑量組 20.29±4.15* 48.86±10.04*紅豆杉多糖中劑量組 20.50±8.43* 48.43±10.89*紅豆杉多糖高劑量組 19.88±8.17* 55.38±14.15*

2.3 各組小鼠肝臟組織勻漿SOD活性及MDA含量比較 與空白對照組比較，D-半乳糖模型組小鼠肝臟組織勻漿中SOD的活性降低、MDA含量升高（P<0.01）。與D-半乳糖模型組比較，紅豆杉多糖低/中/高劑量組及陽性藥物組小鼠肝組織勻漿中SOD活性均提高、MDA含量均降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肝臟組織勻漿SOD活性及MDA含量比較［n=15，（±s）］

表2 各組小鼠肝臟組織勻漿SOD活性及MDA含量比較［n=15，（±s）］

注：與空白對照組比較，△P<0.01；與D-半乳糖模型組比較，#P<0.01，*P<0.05

組別 SOD活力（U·mgprot-1） MDA含量（nmol·mgprot-1）空白對照組 95.14±36.32 1.44±0.47 D-半乳糖模型組 61.01±17.52△ 2.15±0.41△陽性藥物組 89.31±19.11* 1.44±0.53#紅豆杉多糖低劑量組 96.73±40.66# 1.44±0.41#紅豆杉多糖中劑量組 94.39±25.33# 1.48±0.48#紅豆杉多糖高劑量組 87.70±29.42* 1.27±0.45#

2.4 各組小鼠肝組織勻漿的T-AOC比較 D-半乳糖模型組的T-AOC顯著低于空白對照組（P<0.05），陽性藥物組及紅豆杉多糖低/中/高劑量組的T-AOC均高于D-半乳糖模型組（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠肝組織勻漿的T-AOC比較［n=15，（±s）］

表3 各組小鼠肝組織勻漿的T-AOC比較［n=15，（±s）］

注：與空白對照組比較，△P<0.01；與D-半乳糖模型組比較，#P<0.01，*P<0.05

組別 T-AOC（U/mL）空白對照組 0.1715±0.0465 D-半乳糖模型組 0.1157±0.0278△陽性藥物組 0.1720±0.0305#紅豆杉多糖低劑量組 0.1750±0.0539*紅豆杉多糖中劑量組 0.1745±0.0420*紅豆杉多糖高劑量組 0.1773±0.0488*

2.5 各組小鼠肝組織病理組織變化 空白組小鼠鏡下肝細胞排列整齊、緊密，小葉結(jié)構(gòu)完整，細胞內(nèi)未見明顯脂肪變性，血管周圍無明顯炎癥浸潤；D-半乳糖模型組肝細胞排列稀疏，雜亂，細胞界線不清，細胞內(nèi)可見大量的脂肪變性；紅豆杉多糖低/中/高劑量組及陽性藥物組小鼠的肝臟組織可見細胞排列尚整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)存在，血管周圍無明顯炎癥浸潤，肝細胞內(nèi)脂肪變性程度輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織病理結(jié)果（HE×200）

3 討論

機體的抗氧化防御與自身產(chǎn)生的自由基在正常生理條件下可維持相對平衡，機體在衰老過程中會產(chǎn)生大量自由基，當體內(nèi)自由基失衡時，可引起衰老、疾病等。人體內(nèi)的自由基主要是氧自由基，對不飽和共價鍵有特殊親和力，能使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生丙二醛進而破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，使DNA分子解聚進而破壞細胞內(nèi)線粒體導致細胞自溶。機體內(nèi)還有許多抗氧化酶系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等［9-10］。自由基可破壞肝細胞膜、DNA及線粒體，從而引起肝細胞結(jié)構(gòu)、蛋白合成異常以及能量失衡，從而誘發(fā)肝細胞壞死，激活庫普弗細胞導致肝細胞纖維化［11-12］。研究表明，適量的D-半乳糖在代謝過程可通過轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟沁M而參與糖代謝過程，但過量D-半乳糖的攝入可生成大量的超氧陰離子和多種氧化產(chǎn)物，導致細胞氧化損害，進一步引起機體多臟器、多系統(tǒng)功能減退，最終引發(fā)衰老。D-半乳糖建模利用廣泛，造模時間短，成模率較高，模型穩(wěn)定［13-15］。

植物多糖具有廣泛的藥理學作用，在體內(nèi)發(fā)揮的生物活性與其結(jié)構(gòu)和被消化、酵解、吸收的過程有關(guān)，多是在經(jīng)過消化酵解被吸收后進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用［16］。紅豆杉為世界瀕危珍稀植物，其樹皮是著名抗癌物質(zhì)紫杉醇的提取原材料。紅豆杉屬植物含有多種其他類型的化學成分，主要包括黃酮類、木脂素類、甾體類、酚酸類、倍半萜及多糖類化合物等［17］。紅豆杉多糖是利用極性梯度提取技術(shù)在南方紅豆杉枝葉中提純發(fā)現(xiàn)的一種全新的多糖［18］，具有抗腫瘤、防治心肌梗死、抗糖尿病、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能等作用［19-24］。本研究結(jié)果表明，紅豆杉多糖可升高衰老模型小鼠肝組織均漿中的SOD活力、T-AOC，降低小鼠肝組織均漿中MDA含量，改善小鼠血清ALT、AST含量，提示其可能通過提高抗氧化損害從而發(fā)揮改善衰老模型小鼠肝功能的作用，并且無明顯量效關(guān)系。基于此，本課題組將進一步建立體外模型來探討紅豆杉多糖保護衰老模型肝功能作用的具體靶點，為紅豆杉多糖的藥效評價提供數(shù)據(jù)支撐。