右美托咪定對人乳腺癌SKBR-3細胞株MAPK/JNK/Bcl-2信號通路及癌細胞轉移、侵襲的影響

顧健坤 馬偉斌 姚明 周超瑞 陳國慧

乳腺癌的不良預后主要歸因于乳腺癌細胞的高度復發與轉移，進行相關的機制研究對提高乳腺癌患者的生存率至關重要［1-2］。凋亡是程序性的細胞死亡，誘導凋亡已被評估為處置癌細胞最有前途的方法。Bcl-2家族成員主要位于線粒體膜上，并與線粒體膜電位損失和細胞色素c釋放密切相關。促細胞分裂劑活化蛋白激酶（MAPK）的活化參與細胞凋亡［3］，主要通過ERK1/2（p44/p42）、c-Jun氨基末端激酶JNK（p46/p54）和p38激酶三種途徑。ERK1/2（p44/p42）主要被有絲分裂刺激激活，導致細胞生長和存活的生長因子；JNK和p38被DNA損傷，氫激活過氧化物，細胞表面受體Fas，紫外線照射，熱滲透休克，化學治療藥物誘導導致凋亡的細胞死亡［4-5］。右美托咪定是一種具有止痛、鎮靜和血液動力學作用的親脂性α2腎上腺素能激動劑，已廣泛用于減輕應激反應和全身性炎癥、抗焦慮、維持心血管系統的正常功能［6］。研究表明，嗎啡和丙泊酚等麻醉劑可能會影響惡性實體腫瘤的發生發展［7］。本研究主要探討右美托咪定對人乳腺癌SKBR-3細胞株MAPK/JNK/Bcl-2信號通路及癌細胞轉移、侵襲的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀 器 及 試 劑 RPMI-1640培 養 基（Gibco，Invitrogen，5412）、胎牛血清（Gibco，Invitrogen，6541）、TRIzol試劑（Gibco，Invitrogen，63654）、青霉素（碧云天生物技術有限公司，36541）、鏈霉素（碧云天生物技術有限公司，2651）、裂解緩沖液（碧云天生物技術研究所，P0013）、二甲基亞砜（碧云天生物技術有限公司，6325）、BCA蛋白質試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司，5489）、Biotek Elx-800讀板儀（美國賽默飛世爾科技公司）、化學發光底物顯影（Thermo Fisher，美國賽默飛世爾科技公司）、3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）試劑（Sigma Chemical Co，36541）、Giemsa溶液（sigma，62556）、SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（sigma，3246）、SDS-PAGE膜（sigma，45874）、抗MAPK、JNK、Bcl-2（1∶1,000；Cell Signaling Technology Inc，65478、58774、24785）、辣根過氧化物酶二抗的山羊抗兔IgG（1∶1,000；Santa Cruz Biotechnology，USA，36574）、Annexin V試劑盒（美國Becton Dickinson公司，21546）、BD FACS Aria II流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）、計算機輔助圖像分析儀（Olympus Microimage?圖像分析，美國Windows 4.0版軟件）、PrimeScript RT試劑盒（TakaraBio，69584）、半干轉移裝置（伯樂公司Bio-Rad，中國上海）、Molecular Imager Chemidoc XRS System（伯樂公司Bio-Rad，中國上海）、iQTM Green Supermix iQ5實時檢測系統（伯樂公司Bio-Rad Laboratories，美國）、聚偏二氟乙烯膜（密理博公司Millipore，69658）。

1.2 細胞培養及分組 （1）細胞培養：人乳腺癌SKBR-3細胞株細胞獲自西安空軍軍醫大學，在帶濕度培養箱（37 ℃、5%CO2、2% O2、93%N2）和含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養基中培養。（2）分組：①SKBR-3細胞組：細胞濃度為5×106/mL的乳腺癌SKBR-3細胞液在10%FBS的RPMI-1640培養基中培養；②順鉑組：乳腺癌SKBR-3細胞培養方法同前，在培養基中加入順鉑100.0 μg/mL［8］；③右美托咪定低、高劑量組：乳腺癌SKBR-3細胞培養方法同前，分別加入右美托咪定100.0 μg/mL、200.0 μg/mL［9］。以上各組每孔設6個平行樣，培養72 h。

1.3 細胞增殖及克隆形成數目測定 （1）細胞活力測定：使用MTT測定法，將細胞接種在96孔聚苯乙烯培養板中，于37 ℃、5%（v/v）的CO2中溫育24 h，然后從每個孔中除去100 μL培養基，并將100 μL不同濃度的ISO加入細胞中并溫育24 h、48 h。再將溶解于磷酸鹽緩沖鹽水中的100 μL 0.5%（w/v）MTT加入每個孔中，并孵育4 h，之后向每個孔中加入100 μLDMSO。使用Biotek Elx-800酶標儀（中國Bio-Rad實驗室有限公司）測量490 nm處的吸光度。細胞存活率=（實驗組OD-空白組OD）/（實驗組OD-SKBR-3細胞組OD）。（2）克隆形成數目測定：各組乳腺癌SKBR-3細胞培養結束后，將細胞接種在6孔板中，50/孔，37 ℃下孵育14天，PBS洗滌3次，Giemsa溶液染色細胞，從7個隨機視野計算克隆形成數目。

1.4 細胞侵襲轉移水平測定 傷口愈合測試細胞侵襲，將乳腺癌SKBR-3細胞分別接種在多孔板上，并在含有10%FBS的RPMI-1640培養基中培養，直至達到匯合為止，然后使用移液器吸頭（100 μL）閉合傷口。在測試開始時和細胞遷移2 h、4 h、6 h后捕獲圖像，比較圖像以量化細胞的遷移速率。

1.5 細胞凋亡水平測定 采用Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）雙重染色。所有乳腺癌SKBR-3細胞使用Annexin V試劑盒進行染色，1 h內使用流式細胞儀分析細胞。早期凋亡細胞具有暴露的磷脂酰絲氨酸，但完整的細胞膜與膜聯蛋白V-FITC結合，但排除了PI；凋亡晚期的細胞均用膜聯蛋白V-FITC和PI標記，而壞死細胞僅用PI標記。

1.6 細胞MAPK、JNK、Bcl-2基因水平測定 使用TRIzol試劑從培養的細胞中分離出總RNA 0.5 μg。使用PrimeScript RT試劑盒，用1μg總RNA合成第一鏈cDNA。應用SYBR Green qPCR SuperMix-UDG試劑在實時定量PCR使用iQTM Green Supermix iQ5實時檢測系統進行PCR。應用比較循環閾值（Ct）方法通過計算2-ΔΔCt來量化基因表達水平。引物由上海生工科技合成，序列如下：MAPK，正向：5′-CGTGAGTGCCGCCCCCGTGA-3′，反向：5′-GTGTGACCCTGCTGTGCGTGACT-3′；JNK，正向：5′-TGTGACTGTGTCGGCAGCCCGTGACG-3′，反向：5′-CGTACTGCACGAATTCGTACTG-3′；Bcl-2，正向：5′-CCGTACTGACGTCGGCACCGTGAACTG-3′，反向：5′-GTGTGACGGCGAAGTGAC-3′。

1.7 細胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白水平測定 將細胞用PBS（pH 7.4）洗滌2次，并在含有1%PMSF和20 mM NaF的裂解緩沖液中在冰上裂解10 min，然后將其轉移至微量離心管中，將樣品在4 ℃下以15,000 g離心10 min，之后將上清液轉移至新試管中，使用BCA蛋白質試劑盒測定總蛋白濃度。將從細胞制備的勻漿用SDS樣品緩沖液處理，并立即在95 ℃下加熱10 min。蛋白質通過SDS-PAGE膜分離后，使用半干轉移裝置電轉移至聚偏二氟乙烯膜上，在TBST（20 mM Tris，166 mM NaCl和0.05%Tween 20，pH 7.5）中的5%脫脂奶粉中封閉2 h，然后將膜在臺式濃縮器中于室溫下以70 r/min洗滌15 min，該程序重復3遍后，將一抗以建議稀釋度在TBST緩沖液中于4 ℃過夜添加，之后在TBST中洗滌3次，再加入二抗并在25 ℃下孵育2 h。印跡再經TBST洗滌3次，用化學發光底物顯影，并使用Molecular Imager Chemidoc XRS System曝光。

1.8 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組比較采用單方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組乳腺癌SKBR-3細胞的OD值、存活率比較 與SKBR-3細胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的OD值、存活率均降低（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的OD值、存活率升高（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的OD值、存活率降低（P<0.05）。見表1和圖1。

表1 各組乳腺癌SKBR-3細胞的OD值、存活率比較［n=6，（±s）］

表1 各組乳腺癌SKBR-3細胞的OD值、存活率比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 OD值 存活率（%）SKBR-3細胞組 0μg /mL 0.87±0.08 90.32±2.63順鉑組 100.0μg /mL 0.32±0.07a 35.63±3.41a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 0.65±0.05ab 74.63±3.54ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 0.52±0.08abc 56.63±4.23abc

圖1 各組乳腺癌SKBR-3細胞增殖水平比較（倒置顯微鏡×400）

2.2 各組乳腺癌SKBR-3細胞的克隆形成數目比較 與SKBR-3細胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的克隆形成數目降低（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的克隆形成數目升高（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的克隆形成數目降低（P<0.05）。見表2和圖2。

表2 子宮內實性腫塊MRI表現

表2 各組乳腺癌SKBR-3細胞的克隆形成數目比較［n=6，（±s）］

表2 各組乳腺癌SKBR-3細胞的克隆形成數目比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 克隆形成數目（個）SKBR-3細胞組 0μg /mL 1,265.63±26.63順鉑組 100.0μg /mL 325.63±41.63a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 741.63±26.36ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 541.36±23.69abc

圖2 各組乳腺癌SKBR-3細胞的克隆形成數目比較（Giemsa溶液染色×400）

2.3 各組乳腺癌SKBR-3細胞的侵襲遷移能力比較 與SKBR-3細胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組侵襲距離降低（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組侵襲距離升高（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組侵襲距離降低（P<0.05）。見表3和圖3。

圖3 各組乳腺癌SKBR-3細胞的穿膜數目比較（0.1%結晶紫染色×100）

表3 各組乳腺癌SKBR-3細胞侵襲遷移能力的比較［n=6，（±s）］

表3 各組乳腺癌SKBR-3細胞侵襲遷移能力的比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 侵襲距離（um）SKBR-3細胞組 0μg /mL 396.63±33.84順鉑組 100.0μg /mL 90.19±26.48a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 159.48±54.96ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 123.48±18.87abc

2.4 各組乳腺癌SKBR-3細胞凋亡率比較 與SKBR-3細胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的凋亡率升高（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的凋亡率降低（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的凋亡率升高（P<0.05）。見表4和圖4。

表4 各組乳腺癌SKBR-3細胞凋亡率比較［n=6，（±s）］

表4 各組乳腺癌SKBR-3細胞凋亡率比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 凋亡率（%）SKBR-3細胞組 0μg /mL 5.18±0.14順鉑組 100.0μg /mL 36.40±2.27a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 19.00±2.24ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 46.50±2.14abc

圖4 各組乳腺癌SKBR-3細胞凋亡率比較

2.5 各組乳腺癌SKBR-3細胞MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA的表達水平比較 與SKBR-3細胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表達水平降低（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表達水平升高（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表達水平降低（P<0.05）。見表5。

表5 各組乳腺癌SKBR-3細胞的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表達水平比較［n=6，（±s）］

表5 各組乳腺癌SKBR-3細胞的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表達水平比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 MAPK JNK Bcl-2 SKBR-3細胞組 0μg /mL 5.78±0.18 5.36±0.29 6.21±0.20順鉑組 100.0μg /mL 1.45±0.21a 1.68±0.23a 2.12±0.23a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 4.56±0.24ab 4.01±0.16ab 4.21±0.19ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 3.02±0.26abc 3.14±0.19abc 3.10±0.16abc

2.6 各組乳腺癌SKBR-3細胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表達水平比較 與SKBR-3細胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表達水平降低（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表達水平升高（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 蛋白表達水平降低（P<0.05）。見表6和圖5。

圖5 各組乳腺癌SKBR-3細胞MAPK、JNK蛋白表達水平的比較（電泳圖）

表6 各組乳腺癌SKBR-3細胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表達水平比較［n=6，（±s）］

表6 各組乳腺癌SKBR-3細胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表達水平比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 MAPK JNK Bcl-2 SKBR-3細胞組 0μg /mL 6.47±0.19 6.43±0.24 6.24±0.23順鉑組 100.0μg /mL 1.19±0.16a 2.50±0.26a 1.96±0.32a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 3.48±0.19ab 5.12±0.26ab 5.14±0.23ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 1.99±0.19abc 3.15±0.45abc 2.54±0.24abc

3 討論

乳腺癌是最常見的侵襲性腫瘤之一，是全世界女性癌癥死亡的主要原因，每年有近23萬例新病例和4萬例乳腺癌死亡。 乳腺癌的早期檢測、診斷方面雖取得了進步，但外科手術以及放化療之后的復發率呈上升趨勢。因此，尋求乳腺癌新的治療藥物具有重要意義。

嗎啡、戊巴比妥、曲馬多、舒芬太尼和右旋等麻醉劑常被用于癌癥患者的手術中。研究表明，嗎啡皮下注射對于終末呼吸困難的患者非常有效；右美托咪定是一種α2腎上腺素受體激動劑，可用于減輕重癥監護病房患者的全身炎癥和劇烈疼痛，改善機械通氣圍手術期患者的呼吸功能［10］；右美托咪定還具有輻射防護作用，可改善腦腫瘤的放射治療效果，可通過促進肺細胞增殖對肺泡上皮細胞的細胞凋亡起保護作用，此外右美托咪定還能抑制小鼠乳腺腫瘤細胞的侵襲性增殖［11-12］。本研究結果顯示，與SKBR-3細胞組比較，右美托咪定低/高劑量組的OD值、存活率、單克隆形成水平、侵襲距離降低，而凋亡水平升高，說明右美托咪定能夠明顯抑制SKBR-3細胞株增殖、轉移、侵襲，促進其凋亡，右美托咪定的抗癌活性歸因于細胞黏附、增殖、存活、侵襲和細胞外基質降解有關的信號通路的抑制［13］。與其他癌細胞不同，乳腺癌細胞SKBR-3不會通過間充質或類動蛋白運動的活躍機制侵入，而是通過形成腫瘤栓子侵入，在3-D培養中形成球體，球體中的SKBR-3細胞保留了E-鈣黏著蛋白的細胞-細胞黏附力。研究表明，右美托咪定可明顯抑制癌細胞E-鈣黏著蛋白表達水平。

與SKBR-3細胞組比較，本研究順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平降低；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平升高；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的MAPK、JNK、 Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平降低；說明右美托咪定能夠明顯抑制SKBR-3細胞MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平。MAPK涉及細胞生長、分化和凋亡等多種生理過程，絲氨酸/蘇氨酸激酶家族響應于不同的細胞外刺激介導細胞內信號轉導。MAPK是癌細胞生存信號轉導所必需，MAPK的抑制在角鯊烯、紫杉醇、索拉非尼、洛伐他汀、和紫杉醇等各種抗癌刺激中被證實，抑制MAPK信號可以增強順鉑誘導人類肝癌細胞凋亡的能力［14-15］。線粒體介導的凋亡途徑是固有的凋亡途徑，通過細胞色素C的釋放和隨后caspase-3的裂解，最終導致細胞凋亡。Bcl-2家族成員是線粒體釋放細胞色素c的抑制調節劑，可以通過改變其構象在線粒體外膜上形成線粒體通透性過渡孔（mPTP），使細胞色素C從線粒體釋放至細胞質［16］。細胞試驗表明，丁酸可通過抑制人結腸癌RKO細胞中的JNK激酶途徑誘導細胞凋亡，JNK抑制Bcl-2的表達可促進凋亡細胞中細胞色素c的釋放和caspase-3的活化。主要歸因于JNK通過Bcl-2的磷酸化來解離Bcl-2/Bax復合物，最終促進活性Bax從胞質向線粒體區室的轉運并誘導凋亡［17-18］。

綜上所述，右美托咪定能明顯抑制SKBR-3乳腺癌細胞增殖、轉移、侵襲，促進其凋亡，與劑量呈正性相關，作用機制與明顯抑制SKBR-3細胞MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達進而抑制MAPK/JNK/Bcl-2信號通路的激活有關。