常見血液病患者淋巴細胞亞群分析及其臨床意義

黃卉 王恩慧 鄭曉燕

血液病指造血組織、血細胞以及血漿各種成分發生質或量異常的一類疾病。常見的血液病包括再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）、特發性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）、缺鐵性貧血（iron deficiency anemia，IDA）、自身免疫性疾病（autoimmune disorders，AD）、急性白血病（acute leukemia，AL）及非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）。血液病的發生與機體免疫狀態有著密切關系，尤其是細胞免疫，對機體免疫應答起到重要的調節作用［1］，某些類型多伴有淋巴細胞亞群改變［2-3］，發病與淋巴細胞的功能紊亂也有關［4-5］。本研究采用流式細胞術檢測常見血液病患者的外周血淋巴細胞亞群，探討其細胞免疫功能的變化，為血液病的診斷及療效判斷提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2020年9月至2021年8月在衢州市人民醫院確診為血液病的患者250例。（1）納入標準：各類血液病均符合其臨床及國際診斷標準；在本院進行各項檢查、治療；臨床資料完整；簽署知情同意書。（2）排除標準：其他血源性疾病；心、肝、腎等器官功能不全者；服用免疫調節藥或抗凝藥者；有急慢性感染史者。其中，AA 18例，ITP 31例，IDA 36例，AD 43例，AL 33例，NHL 94例；男107例，女143例；年齡12～89（57±16）歲。另選取同期在本院進行健康體檢者30例作為對照組。兩組的年齡、性別比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 CYTOMICS FC500型流式細胞儀（美國Beckman-Co uLter公司）、低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）、漩渦振蕩器、合適量程加樣槍。四色淋巴細胞亞群分析組合熒光抗體（批號：7580216、7536286），細胞裂解液（美國Beckman-Co uLter公司）。

1.3 檢測方法 （1）抽取所有研究對象的靜脈血1～2 mL置于EDTA抗凝管中，20°～25°室溫下存放，在24 h之內提取抗凝血標本100 μL，分別加入2支一次性試管（12 mm×75 mm）中，其中1支試管加入定量的復合熒光抗體（CD45-FITC、CD4-RD1、CD8-ECD和CD3-PC5）10 μL，另1支試管加入定量的復合熒光抗體（CD45-FITC、CD56-RD1、CD19-ECD、和CD3-PC5）10 uL，漩渦振蕩器混勻。室溫下避光反應10 min，加入細胞裂解液0.5 mL，漩渦振蕩器混勻。避光反應10 min，加入PBS緩沖液3 mL，置于低速離心機中，以1,500 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS緩沖液3 mL，以1,500 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS緩沖液混勻，放入檢測儀器進行檢測。（2）采用貝克曼庫爾特 Kaluza 2.3分析軟件，對所有研究對象外周血淋巴細胞亞群流式細胞儀檢測結果進行設門分析，選取CD45+側向角散射光低的淋巴細胞群，分析CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+T淋巴細胞、CD3+CD8+T淋巴細胞、CD3-CD19+細胞及CD3-CD56+淋巴細胞占總淋巴細胞群體的百分比。

1.4 統計學方法 采用SPSS 28.0統計軟件。計量資料符合正態分布以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

AA、ITP、IDA、AD、AL和NHL六種血液病患者的外周血淋巴細胞亞群檢測結果與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組外周血淋巴細胞亞群檢測結果比較［%，（±s）］

表1 各組外周血淋巴細胞亞群檢測結果比較［%，（±s）］

注：與對照組比較，*P<0.05

組別 n CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3-CD19+ CD3-CD56+ CD4+/CD8+對照組 30 71.09±5.83 40.68±4.50 25.62±4.99 11.72±3.52 15.13±5.39 1.68±0.44 AA 18 74.86±11.07 38.08±14.43 32.78±15.23* 12.33±5.78 11.79±8.76 1.58±1.10 ITP 31 73.77±11.06 39.14±13.08 30.08±12.92* 12.30±8.22 11.75±9.49* 1.74±1.29 IDA 36 67.99±10.62 34.38±10.09* 31.22±8.44* 11.72±7.80 14.79±8.09 1.25±0.69*AD 47 74.3±1.92 43.93±1.82 25.82±1.54 15.20±1.70* 8.54±1.25 * 2.15±0.26*AL 33 63.91±10.09* 30.29±8.13* 29.51±8.54* 17.15±10.72* 11.92±6.8* 1.16±0.66*NHL 94 74.10±16.18* 33.27±14.08* 37.17±17.73* 7.10±12.57* 15.65±10.89 1.22±0.87*

3 討論

血液病的發病機制與免疫功能密切相關。隨著免疫學發展及免疫功能檢測技術的進步，淋巴細胞亞群的分類更加精細化，并且各亞群在免疫網絡中的作用日漸明顯［6］。在多種病理狀況下，T淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8比例和比值的變化和B細胞、NK細胞數量的變化，均可以反映機體的細胞免疫功能。總T細胞中，CD4+T淋巴細胞主要具有介導輔助細胞及體液免疫功能，而CD8+T細胞具有抑制或殺傷功能效應。B細胞主要負責體液免疫，產生抗原特異性抗體。NK細胞則發揮非特異性細胞毒性效應，在免疫調節、免疫監視和早期抗感染起作用。

本研究結果顯示，AA患者CD8+T細胞比例顯著升高，表明存在T細胞亞群的紊亂。有研究認為，CD8+T細胞細胞毒作用增強是導致骨髓造血功能明顯抑制的一大原因［7-8］。ITP患者CD8+T細胞比例明顯增高，表明存在T細胞亞群的紊亂。有研究認為，CD8+T細胞增高可能與ITP新的一種發病機制有關，體內抗原表達異常，激活自身反應性T細胞，進而誘導血小板自身抗體增多所致［9-10］。同時，ITP患者NK細胞比例明顯下降，是因為ITP患者的NK細胞缺乏IL-18受體，使NK細胞接受外源性刺激受損，從而使體內NK細胞的發育產生障礙、功能降低［11］。而IDA患者CD4+T細胞比例及CD4+/CD8+比值降低，CD8+T細胞比例相對升高，是因為鐵元素的缺乏使得DNA合成酶活性下降，干擾T淋巴細胞的合成及細胞殺傷機制，造成IDA患者體內免疫功能的紊亂［12］。AD患者的CD4+/CD8+比值較對照組顯著增高，提示患者外周血細胞免疫功能處于“過度活躍”狀態，出現自體免疫反應，這些表現均與自身免疫性疾病的發病機制相關［4，5，13］。有研究表明，DNA甲基化的水平對B細胞的生長發育及細胞因子的分泌都有調控作用，而AD患體內B細胞DNA甲基化水平下降，使自身反應性的B細胞大量增殖［14］。AD患者NK細胞比例的降低，與NK細胞對抗自身免疫性疾病炎癥反應消耗有關［15］。AL患者總T細胞、CD4+T細胞、NK細胞比例及CD4+/CD8+比值均較對照組顯著降低，提示患者機體對惡性細胞的免疫監視減弱，清除白血病細胞的能力下降，由此可見細胞免疫功能失調是促成白血病的重要因素。而NK是第三類淋巴細胞，對腫瘤的直接殺傷和清除具有重要作用，NK細胞的顯著減少也對白血病的發生有著重要影響［2-3］。NHL患者的CD4+T細胞比例較對照組顯著降低，提示參與細胞免疫的淋巴細胞減少，從而使得免疫功能下降；CD8+T細胞比例較對照組顯著增高，提示殺傷作用的效應細胞增高，但因其會抑制免疫系統中發揮主要作用的CD4+細胞數量，從而進一步抑制細胞免疫，最終導致機體對惡性細胞的免疫監視減弱或降低免疫反應，降低機體清除惡性細胞的能力，使淋巴瘤細胞持續生長［16］。AL患者中B細胞占比增高和NHL中的B細胞占比下降，分析與研究對象外周血中B細胞病變占比有關，具體影響因素及原理還有待進一步的研究。

綜上所述，血液病患者存在不同程度的細胞免疫功能紊亂，利用流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群的方法簡便易行，可為血液病的診斷和療效判斷提供依據。