高效液相色譜法檢測飼料中6 種游離氨基酸

劉成模， 楊 曦 ， 莫彩娜， 陳小燕， 任秋香， 黃智成

（1.廣東恒興飼料實業股份有限公司，廣東湛江 524094；2.農業農村部華南水產與畜禽飼料重點實驗室，廣東湛江 524094）

飼料蛋白質的氨基酸不平衡會降低蛋白質效率， 用合成的氨基酸來平衡飼料中氨基酸比例是提高飼料蛋白質利用率和節約蛋白質資源， 降低飼料成本的途徑之一 （占秀安等，2007）。 在水產養殖中，牛磺酸主要被用作蝦類誘食劑（Fuzessery 等，1978）。 有研究表明，比目魚飼料中添加1.4%的牛磺酸能顯著促進其生長，提高蛋白質效率比（Park 等，2002）；草魚飼料中適量添加牛磺酸（200 ～1400 mg/kg），能提高特定生長率、飼料效率和蛋白質效率，降低草魚體水分，增加體蛋白和體脂（蘿莉等，2006）。因此，準確、快捷、低成本地測定飼料中牛磺酸（Taurine）、蘇氨酸（Thr）、甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）6 種游離氨基酸含量，對于飼料配方設計，提高養殖效率具有十分重要的意義。

GB/T 18246-2019《飼料中氨基酸的測定》對飼料中游離氨基酸的測定采用氨基酸分析儀檢測，氨基酸分析儀成本比較高，檢測時間也比較長，不利于一般企業開展，同時也不利于大批量樣品檢測。 本實驗采用0.1 mol/L 鹽酸溶液提取樣品中的6 種游離氨基酸， 與1% 2，4-二硝基氟苯（DNFB）溶液衍生后經高效液相色譜儀測定其含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（配紫外檢測器和工作站）， 美國安捷倫科技（中國）有限公司；PHS-3E pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；DK-BD 型電熱恒溫水浴箱， 上海新諾儀器設備有限公司。

1.1.2 主要試劑 6 種氨基酸標準品： 牛磺酸（Taurine）、蘇 氨 酸（Thr）、甘 氨 酸（Gly）、纈 氨 酸（Val）、 蛋氨酸 （Met）、 賴氨酸 （Lys）（純度均≥98%），美國Sigma 公司；2，4-二硝基氟苯（DNFB）（＞99.0%），麥克林公司；乙腈為色譜純，無水乙酸鈉、磷酸二氫鈉、無水碳酸鈉、氫氧化鈉均為分析純；水為GB/T 6682 規定的一級水。

1.2 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C18 （4.6×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測波長：360 nm；梯度洗脫程序如表1 所示。

表1 梯度洗脫程序

1.3 樣品前處理 稱取已制好的飼料樣品2 g（準確至0.0001 g）于100 mL 燒杯中，加入50 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液，用玻璃棒攪拌約1 min，置于超聲波儀中常溫超聲30 min（中間用玻璃棒攪拌2 次），超聲完畢后用氫氧化鈉溶液調溶液至中性（先加0.4 mL 40%氫氧化鈉溶液， 再用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液慢慢調成中性）， 然后轉移到100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻。 最后取約50 mL 溶液于離心管中，4000 r/min 離心10 min，上清液待用。

1.4 衍生化 分別移取500 μL 上述上清液和6種游離氨基酸標準系列混合液于帶蓋試管中，依次準確加入500 μL 碳酸鈉緩沖溶液 （pH=9.0）、500 μL 1%（DNFB）2，4-二硝基氟苯溶液，蓋上塞子，漩渦混勻，于60 ℃水浴中避光反應60 min。取出，冷卻至室溫，再加磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）3.5 mL，漩渦混勻，靜置15 min。 衍生后的試液過0.45 μm 水系濾頭過濾，濾液上機待測。

2 結果

2.1 提取方式和提取時間的選擇 稱取同一份已制好飼料樣品，分別采用振蕩和超聲兩種方式提取，每種提取方式分別進行5、15、30、40、50、60 min。 由表2 可知， 不同時間振蕩和超聲提取結果基本相同，說明振蕩和超聲兩種方式對6 種游離氨基酸的提取無影響， 為確保6 種游離氨基酸能夠完全提取，本實驗選擇超聲提取，提取時間為30 min。

表2 振蕩和超聲不同時間提取效果%

2.2 提取后樣品溶液pH 的選擇 氨基酸和衍生劑2，4-二硝基氟苯反應所需的環境為弱堿性，加入500 μL 碳酸鈉緩沖液（pH=9.0）確保反應環境為弱堿性，提取液為0.1 mol/L 鹽酸溶液，酸性，故在衍生前對樣品進行堿化。 由表3 可知， 樣品pH 為3 ～9 時，6 種游離氨基酸的結果基本相同，說明樣品pH3～9 對種游離氨基酸的結果基本沒有影響，但衍生劑產物色譜峰隨pH 增大而升高，因此本實驗選擇將樣品提取液pH 調成7，接近標準溶液pH。

表3 提取后樣品溶液pH對游離氨基酸含量的影響%

2.3 衍生劑用量和衍生時間的選擇 對同一飼料樣品分別加1% 2，4-二硝基氟苯溶液50、100、200、300、400、500、600、700 μL，最后加入磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）至溶液體積為5 mL。由表4 和表5可知，衍生劑用量從50 ～500 μL 時，隨衍生劑用量加大，6 種游離氨基酸結果不斷增大， 衍生劑用量超過500 μL 后，6 種游離氨基酸的結果基本相同，說明衍生劑用量低于500 μL，6 種游離氨基酸與衍生劑反應不完全。 衍生時間從5 ～60 min 時， 隨衍生時間越長，6 種游離氨基酸結果不斷增大，衍生劑時間超過60 min 后，6 種游離氨基酸的結果基本相同， 說明衍生時間低于60 min，6 種游離氨基酸與衍生劑反應不完全。說明樣品中6 種游離氨基酸與衍生劑完全反應需要至少500 μL 衍生劑反應60 min 以上，但衍生劑產物色譜峰隨衍生時間延長而升高。 因此，本實驗選擇衍生劑為500 μL 1% 2，4-二硝基氟苯溶液和衍生時間60 min。

表4 衍生劑用量對游離氨基酸含量的影響%

表5 衍生時間對游離氨基酸含量的影響%

2.4 線性關系、 線性范圍、LOD 和LOQ 取6種 標 準 濃 度 為10、20、50、100、150、200 μg/mL混合氨基酸500 μL 按本實驗操作，以氨基酸質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到6 種氨基酸的工作曲線、線性范圍，在本實驗條件下，按信燥比S/N=3 計算，求得飼料中的（LOD）檢出限，按信燥比S/N=10 計算，求得定量限（LOQ），結果見表6。

表6 線性關系、線性范圍、LOD 和LOQ

2.5 穩定性實驗 取已處理好的供試溶液， 按本實驗色譜條件，分別在0、4、8、12、16、24 h，測其峰面積，6 種游離氨基酸RSD 為0.526% ～0.865%，結果表明供試溶液24 h 內基本穩定（表7）。

表7 穩定性實驗數據

2.6 重復性實驗 取同一飼料樣品6 份，按本實驗測定，6 種游離氨基酸的含量以變異系數CV計為2.55% ～2.76%。

表8 重復性實驗

2.7 加標回收率實驗 稱取已知含量飼料6 份，分別添加一定濃度的6 種游離氨基酸標準品，采用本實驗方法進行測定， 計算回收率， 結果見表9，6 種游離氨基酸最低回收率超過92%。

表9 添加不同水平游離氨基酸回收率%

2.8 國家標準方法與本實驗方法結果對比 取不同飼料樣品， 分別采用本方法與標準方法檢測6 種游離氨基酸。 結果表明，兩種方法的測定結果無顯著性差異（表10）。

表10 不同樣品國家標準方法與本方法結果比對%

3 討論

因為大多數氨基酸不含芳香環等紫外或可見光吸收基團， 無法直接用紫外和可見光吸收法檢測， 需先將氨基酸衍生轉化成具有較強紫外或者熒光吸收的衍生產物。 衍生方式有柱前衍生法和柱后衍生法。 柱后衍生法的主要缺點：（1）色譜儀器較復雜， 需額外的泵和反應器以保證洗脫液與柱后試劑均勻組合，這樣使儀器局限于一類分析。（2）在茚三酮方法中單波長影響因素比較大，常需雙波長檢測，使儀器更加復雜、昂貴。 故本實驗采用柱前衍生檢測飼料中游離氨基酸含量。 一般用于柱前衍生劑有異硫氰酸苯酯、 丹磺酰氯、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸、 鄰苯二甲醛、9-芴基甲氧基羰酰氯和2，4-二硝基氟苯等。 綜合考慮柱前衍生劑優缺點， 本實驗采用2，4-二硝基氟苯作為柱前衍生試劑。

4 結論

本實驗采用高效液相色譜法同時檢測飼料中6種游離氨基含量，實驗結果表明，該方法分析速度快，回收率和重復性比較好。與國家標準方法檢測結果進行比對，檢測結果無顯著性差異，是一種可快速、準確測定飼料中6 種游離氨基酸含量的方法。