抗水產病原菌乳酸菌的篩選及其發酵飼料的制備

劉 穎， 王 洋，2 ， 馮小蕓， 王競儒， 黃俊霖， 白東清 ， 趙建忠， 李長娥

（1.天津農學院水產學院，天津西青 300384；2.農業農村部農業微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081；3.天津市武清區崔黃口鎮人民政府農業服務中心 301702；4.天津市武清區農業發展服務中心，天津 301700）

抗生素在水產養殖業中的限制使用， 驅動了綠色抗菌物篩選和應用研究的開展。 乳酸菌作為益生菌，具有良好的安全性和抗菌性，被廣泛用于食品加工、畜禽及水產養殖中（Anas 等，2021 ）。 乳酸菌可分泌多種抗菌物質，包括有機酸、抗菌肽、過氧化氫等（范玲玉等，2021），因此對病原微生物有廣譜抑制作用，且不易產生耐藥性，乳酸菌在養殖業中具有取代抗生素的潛力（姚嘉赟等，2020）。

乳酸菌用于動物養殖的常見方式包括拌料投喂和制備發酵飼料。 以乳酸菌作為發酵劑制備的飼料具有改善飼料品質、提高飼料價值、改善腸胃功能和促進水產動物生長等多種作用（駱薇竹等，2020）。 乳酸菌發酵過程中可產生多種氨基酸、維生素等飼料原料中沒有的成分， 從而提高水產動物生產性能（王磊等，2020；王雁燦等，2017）。乳酸菌代謝可產生多種抗菌物質， 其代謝物或菌體成分還有免疫調節活性， 因此可提高水產動物抗細菌病的能力 （Ng 等，2020；Tkhruni 等，2020）。 此外，乳酸菌發酵可改善水產飼料適口性，誘食效果好（Nguyen 等，2017）。

本研究篩選對水產病原菌有抑制作用的乳酸菌，并制備發酵飼料，研究發酵飼料對水產病原菌的抑制作用，以及對水產益生菌生長的影響，旨在豐富我國水產抗病型益生乳酸菌資源， 并為抗菌型發酵水產飼料的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 乳酸菌菌株分離自天津地區池塘、魚蝦糞便、腸道以及各類發酵食品，現保存于天津市水產生態及養殖重點實驗室。

指示菌：嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）ATCC 35654，嗜水氣單胞菌CICC 10500，副溶血弧菌 （Vibrio Parahemolyticus） ATCC 17802，購自中科質檢有限公司， 北京； 坎氏弧菌（Vibrio campbellii），哈維氏弧菌（Vibrio harveyi），輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus），以及嗜水氣單胞菌245，均分離自天津地區發病魚， 并經過16S rDNA 序列分析鑒定為相應菌種， 現保存于天津市水產生態及養殖重點實驗室。

細菌培養基：MRS 瓊脂、MRS 肉湯、LB 瓊脂、LB 肉湯，購自北京陸橋技術股份有限公司。

多功能酶標儀（4MK2）、高速冷凍離心機（YZB/GER 1841-2014），賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 乳酸菌發酵上清液抑菌能力的測定 分離得到的乳酸菌在MRS 液體培養基中培養24 h，離心（2000g、5 min、4 ℃），收集上清液，以0.22 μm無菌濾器過濾除菌后立即使用。 采用雙層平板瓊脂擴散法（魏東東等，2018），測定各菌株發酵上清液的抑菌圈直徑。 上層平板中分別含各種指示菌107cfu/mL，牛津杯中加入100 μL 乳酸菌上清液，于4 ℃正置8 ～12 h， 至上清液全部擴散到瓊脂中，隨后于30 ℃培養12 h 后觀測抑菌圈直徑。

1.3 飼料發酵條件的優化 采用Designer Expert（DX） 軟件設計，以響應曲面法優化接種量、加水量和發酵時間。根據設計的條件制備發酵飼料。在發酵終點取樣，檢測飼料pH（國標GB 6920-86），活菌數（梯度稀釋平板計數法），以及飼料穩定性。飼料穩定性的測定指標為飼料保留率：保留率/%＝[浸泡海水后質量 （干重）/飼料浸泡海水前重量（干重）]×100%（賈雪卿，2017）。 響應值計算方法為活菌數+保留率/10 的平均值。

1.4 乳酸菌發酵飼料對病原菌和益生菌生長的影響 將制備好的發酵飼料，以LB 或者MRS 肉湯浸泡24 h，在6000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，取上清液。上清液以0.22 μm 無菌濾膜過濾除菌，制得發酵飼料無菌浸提液。 采用96 孔板比濁法，檢測不同終濃度（11.25%、22.5%、45%）的發酵飼料無菌浸提液對水產病原菌的生長抑制作用，以及對益生芽孢桿菌和乳酸菌生長的影響。

1.5 數據處理 試驗所得數據利用Excel 軟件計算得出各組數據的標準偏差； 利用Sigmaplot 14.0 軟件繪制柱狀圖；利用MEGA 構建系統發育樹； 利用SPSS 軟件進行單因素方差分析（SNK，α＝0.05 或0.01）。 每次試驗重復3 次，每次重復包含至少3 個平行數據。

2 結果

2.1 抑菌乳酸菌的篩選和16S rDNA 序列分析分離自各類生境的33 株乳酸菌，其發酵上清液對6 株病原菌有不同程度的抑制作用 （黃俊霖，2019）（表1）。 綜合考慮對各株指示菌抑菌圈直徑的總和，抑菌能力較強的菌包括屎腸球菌7-1（高欣，2020），以及菌株A1 和A2。 屎腸球菌7-1 的發酵上清液，對輪蟲弧菌、嗜水氣單胞菌35654、嗜水氣單胞菌10500、維氏弧菌、坎氏弧菌、嗜水氣單胞菌245 抑菌直徑分別達到了（29±2），（39±1），（29±1），（36±1），（34±3），（23±1）mm。

表1 乳酸菌發酵上清液pH 及其對6 株革蘭氏陰性水產病原菌的抑菌圈直徑mm

進一步鑒定優良菌株A1 和A2，并進行測序分析（圖1）。 結果表明，菌株A1 的序列與乳酸乳球菌 （Lactococcus lactis）subsp.lactis Il1403 的序列最為相似，菌株A2 的序列與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）WCFS1 的序列最為相似。 因此將菌株A1 和A2 分別鑒定為乳酸乳球菌和植物乳桿菌。

圖1 基于16S rDNA 建立的菌株乳酸乳球菌A1 和植物乳桿菌A2 的系統發育樹

2.2 發酵條件響應曲面優化結果 選用抑菌能力最強的屎腸球菌7-1 制備發酵飼料，并優化發酵條件（馮小云，2021）。響應值為活菌數和飼料穩定性的加權值，所得數據結果見表2。 各組發酵飼料的活菌數為6.34 ～7.47 log10cfu/g。 其中第11組活菌數最高。 各組發酵飼料保留率為60% ～99%，其中第7、8 和9 組發酵飼料的保留率較高，均在90%以上。 根據發酵飼料保留率和終末活菌數的權重值即響應值， 擬合并繪制響應曲面（圖2）。17 個試驗組響應值為6.2 ～8.46。響應值越大表明該發酵條件越適合。根據擬合的響應曲面，給出了幾組優化發酵條件。綜合發酵成本考慮，選用發酵接種量4.53 log10cfu/g，發酵時間12.5 h 以及加水量0.784 mL/g 干飼料。 該組條件驗證的結果為： 活 菌 數 （7.47±0.02）log10cfu/g， 保 留 率86.89 %，實測值與預測值的誤差小于2%，證明該條件適宜。

圖2 根據不同發酵條件下屎腸球菌發酵飼料的加權得分繪制的響應曲面和等高線圖

表2 根據響應曲面設計所得各組屎腸球菌7-1 發酵飼料的參數及響應值

2.3 屎腸球菌發酵飼料對水產病原菌的抑制不同濃度屎腸球菌發酵飼料無菌浸提液對革蘭氏陰性病原菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌、維氏氣單胞菌、坎氏弧菌、輪蟲弧菌、3 株嗜水氣單胞菌有顯著生長抑制作用（P＜0.05），抑制效果如圖3 所示。 隨著飼料發酵浸提液濃度的增加， 除副溶血弧菌和維氏氣單胞菌外， 浸提液對其他6 株水產病原菌的抑制能力逐漸增強。

圖3 屎腸球菌發酵飼料對水產病原菌的抑制作用

2.4 屎腸球菌發酵飼料對水產益生菌生長的影響 不同濃度屎腸球菌發酵飼料無菌浸提液對常見水產益生菌枯草芽孢桿菌以及肉葡萄球菌、清酒乳桿菌和戊糖乳桿菌的生長影響如圖4 所示。與對照組相比， 無菌浸提液對水產益生菌有生長促進作用，但隨著浸提液濃度的增加，生長促進的幅度顯著下降（P＜0.05）。

圖4 屎腸球菌發酵飼料對水產益生菌生長的影響

3 討論

3.1 乳酸菌對水產病原菌的抑制能力 本研究從水產生境和食品中分離的乳酸菌菌株， 其中部分菌株的發酵上清液對6 株常見水產病原菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌、維氏弧菌、坎氏弧菌、輪蟲弧菌、嗜水氣單胞菌有較強的抑制作用。 Klewicki和Klewicka（2004）認為，魚腸道中乳酸菌的抑菌能力源于其可以降低腸道環境的pH 并產生抑菌物質。本研究中抑菌能力最強的屎腸球菌7-1，分離自金魚糞便， 水產生境以及其產細菌素特性可能是其有較強抑菌能力的原因 （高欣等，2020；Fekaninová 等，2019；Kassaa 等，2019）。據報道，水生動物腸道中固有的乳酸菌中， 一些優勢菌株有產細菌素的能力 （崔美巖等，2016）。 Ringo/等（1998）， 提出將產細菌素乳酸菌作為水產益生菌，有替代抗生素使用的潛力（O'ldak 和Dosw，2017）。

3.2 屎腸球菌發酵飼料的發酵參數 本研究從各類生境中篩選到的乳酸菌株， 對水產常見病原菌有不同程度的抑制作用， 其中抑菌能力較強的為屎腸球菌、 乳酸乳球菌和植物乳桿菌。 經過優化確定了利用屎腸球菌7-1 制備發酵飼料的條件為發酵接種量4.53 log10cfu/g，發酵時間12.5 h以及加水量0.784 mL/g 干飼料，發酵后活菌數可達到7.47 log10cfu/g，發酵飼料的無菌浸提液對水產病原菌有顯著抑制作用， 對益生菌有生長促進作用。王競儒等（2019）制備對蝦發酵飼料的條件，獲得的活菌數為6.48×108cfu/g。 馬小康等（2018）制備的活菌飼料中活菌數達到了108cfu/g。 Zhang等（2020）制備的發酵飼料活菌數為1×108cfu/g，能明顯抑制蝦腸道內病原菌的生長。可見，本研究所獲得的發酵飼料活菌數數量適宜。 研究結果初步證實了屎腸球菌7-1 具備制備抗病發酵飼料的潛力，繼續開展屎腸球菌7-1 發酵飼料的投喂試驗， 有利于進一步明確該菌株及其發酵飼料對水產動物抗病性的影響。