MTHFR基因C677T多態性、血清Hcy水平與少弱精子癥不育患者精液質量的關聯性研究

趙蕾，李娟

(1.十堰市太和醫院生殖醫學中心，十堰 442000；2.十堰市婦幼保健院產科，十堰 442000)

男性不育具有復雜性和多樣性特點，精子發生、成熟、輸送任意環節出現問題均可引起男性不育[1]。少弱精子癥指精子濃度且活力低于參考值下限，其在男性不育中約占46%[2]。隨著男科學研究進展及人類基因組計劃完成，不少學者已關注到基因多態性與少弱精子癥的關系[3]。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是一種葉酸與同型半胱氨酸(Hcy)代謝中重要的黃素依賴酶，可通過介導5，10-亞甲基四氫葉酸向5-甲基四氫葉酸轉變，參與DNA合成、修復及DNA甲基化過程[4]。MTHFR基因有二十多個多態性位點，其中以MTHFR基因C677T多態性常見，其C→T突變可引起MTHFR耐熱性及活性降低[5]。研究指出，MTHFR活性降低可限制體內Hcy向甲硫氨酸的轉化，導致血清Hcy水平升高，而Hcy具有細胞毒性，在人類心腦血管疾病、免疫相關疾病等多種疾病的發生中占重要地位[6]。既往研究顯示，MTHFR基因C677T多態性可能通過介導高Hcy血癥參與冠脈病變[7]。目前關于MTHFR基因C677T多態性、血清Hcy水平與少弱精子癥患者的不育關系尚無定論，本研究通過探究少弱精子癥患者MTHFR基因C677T多態性及血清Hcy水平變化，分析二者與精液質量相關性，旨在為該類人群的臨床診療提供參考。

資料與方法

一、研究對象

選取2019年4月至2021年4月于十堰市太和醫院生殖醫學中心就診的少弱精子癥不育男性102例，設為研究組。

納入標準：(1)夫婦婚后同居≥1年，正常性生活未避孕下不育，且排除女方因素；(2)2次檢查(間隔時間≥2周)均提示精液中精子濃度<20×106/ml、精子活力(a級+b級)<50%且a級<25%；(3)年齡22～45歲；(4)無特殊既往史、家族史。

排除標準：(1)生殖器發育異常者；(2)染色體核型異常者；(3)合并隱睪、嚴重精索靜脈曲張、附睪損傷、生殖系統感染等已知可能影響精液質量的疾病；(4)合并嚴重心腦血管疾病、神經系統疾病、免疫相關疾病；(5)近期有影響生精藥物服用。

另選取同期80例育前檢查正常的男性為對照組，對照組連續2次精液質量均正常，排除標準同研究組。該研究已通過倫理委員會審查批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.MHTFR基因型檢測：EDTA-2Na抗凝管收集患者空腹肘靜脈血4 ml，混勻后于-70℃保存備用。取冷凍樣本于37℃水浴下復融，采用全血基因組DNA提取試劑盒(溶液型，上海索萊寶生物)提取基因組DNA，采用紫外分光光度計檢測基因組DNA純度，OD260/280比值1.8～2.0間視為DNA溶液純度佳。PCR反應進行目的基因擴增，上游引物序列5’-CAGTCCCTGTGGTCTCTCTTCAT-3’、下游5’-CTCACCTGGATGGGAAA-GAT-3’，引物設計及合成由上海生工生物工程有限公司完成。PCR反應體系共25 μl，包括基因組DNA 1 μl、上下游引物(100 mmol/L)各1 μl、Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.125 μl、10×PCR buffer 2.5 μl、dNTP(2.5 mmol/L)2 μl、補充去離子水至總體積25 μl。PCR反應條件：94℃預熱3 min，94℃變性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35個循環，72℃終延伸5 min。采用ABI 3500dx型測序儀(AB公司，美國)進行PCR擴增產物的測序分析，由上海生工生物工程有限公司完成，依據相關基因位點比對結果分為野生型(CC型)、雜合突變型(CT型)、純合突變型(TT型)。

2.血清Hcy檢測：采集患者空腹靜脈血2 ml，經3 000 rpm離心10 min分離血清，應用AU-2700型全自動生化分析儀(OLYMPUS，日本)，采用酶循環法檢測Hcy水平，檢測步驟嚴格按試劑盒(上海信裕生物科技)說明書操作。

3.精液檢測：研究對象禁欲3～7 d后，通過手淫方式收集精液標本，充分液化后，采用精子自動檢測分析系統(ZKPACS-E型，北京中科恒業科技)行精液常規分析，包括精子總數、精子濃度、精子總活力及前向運動精子百分率。采用精子染色質擴散法(SCD法，深圳博銳德生物)檢測精子DNA碎片指數(DFI)，操作嚴格按試劑盒說明書進行，檢測結果于400倍鏡下觀察，根據光暈有無及大小評價精子DNA碎片化情況，其中無光暈或小光暈(即精子頭直徑≤1/4)視為精子DNA斷裂為碎片。

三、統計學分析

結 果

一、一般資料比較

兩組研究對象間年齡、體質量指數(BMI)、睪丸體積(左、右)、末次排精時間、精液酸堿度、吸煙史等基本資料的比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 一般資料比較[(-±s)，%]

二、MTHFR基因C677T多態性基因型及等位基因頻率分布比較

統計結果顯示，研究組與對照組MTHFRC667T基因型分布差異有統計學意義(χ2=10.705，P<0.05)；研究組CC型頻率、C等位基因頻率顯著低于對照組，而T等位基因頻率顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 MTHFR基因C677T多態性基因型及等位基因頻率分布比較[n(%)]

三、MTHFR基因C677T多態性與少弱精子癥易感性關系

調整年齡、BMI、吸煙史后，攜帶MTHFRC667T TT基因型、CT基因型男性少弱精子癥易感性分別是CC型的4.152倍[95%CI(1.331，12.768)]、2.001倍[95%CI(1.126，3.875)]；攜帶MTHFR基因C677T的T等位基因是C等位基因的1.902倍[95%CI(1.175，2.948)](表3)。

表3 MTHFR基因C677T多態性與少弱精子癥易感性關系

四、血清Hcy水平及精液質量比較

統計結果顯示，研究組血清Hcy水平及DFI水平均顯著高于對照組(P<0.05)，精子總數、精子濃度、精子總活力、前向精子運動率均顯著低于對照組(P<0.05)(表4)。

表4 兩組血清Hcy水平及精子質量比較(-±s)

五、不同基因型患者血清Hcy水平及精液質量比較

將102例少弱精子癥患者按基因型分組，比較不同MTHFRC667T基因型患者血清Hcy水平及精液質量指標的差異。統計結果顯示，不同基因型間的血清Hcy水平及精液質量指標均有顯著性差異(P<0.05)，其中血清Hcy水平、DFI水平均表現為TT型>CT型>CC型(P<0.05)，精子總數、精子濃度、精子總活力、前向精子運動率均表現為TT型

表5 不同基因型患者血清Hcy水平及精子質量比較(-±s)

六、少弱精子癥患者Hcy水平與精液質量相關性分析

Pearson相關分析顯示，少弱精子癥患者血清Hcy水平與精子總數(r=-0.277)、精子濃度(r=-0.446)、精子總活力(r=-0.528)、前向精子運動率(r=-0.495)均呈負相關(P<0.05)，與DFI呈正相關(r=0.671，P<0.05)。

討 論

精子作為男性生殖的最終效應細胞，其數量多少、活力高低可決定受精成功與否，而精子的發生受多基因相互作用調控，探究相關基因遺傳多態性能一定程度上解釋精子發生障礙和男性不育機制[8]。MTHFR作為葉酸與Hcy代謝中的重要酶，可介導5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，前者與DNA合成、修復關聯密切，后者可為DNA甲基化反應提供原料[9]。MTHFR基因定位于染色體lp36.3，目前已發現該基因20多個多態性位點，其中與疾病相關的多態性位點報道也越來越多[10]。MTHFR基因C677T是常見多態性位點，位于MTHFR催化區，當該位點胞嘧啶(C)為胸腺嘧啶(T)替代后，編碼的丙氨酸由纈氨酸取代，并產生一個Hinfl和Taql限制性酶切位點，可引起MTHFR耐熱性、活性降低[11]。MTHFRC667T基因型分布頻率在不同國家、不同地區及不同種族之間均存在差異[12]。本文研究發現，研究組CC型、C等位基因頻率較對照組低，T等位基因頻率較對照組高，提示MTHFRC667T基因多態性可能與少弱精子癥發生有關。調整年齡、BMI、吸煙史后，發現TT基因型、CT基因型少弱精子癥風險分是CC型的4.152倍、2.001倍，攜帶MTHFR基因C677T的T等位基因易感性升高1.902倍，提示TT型、CT型是少弱精子癥的易感基因型，T等位基因是其易感基因。推測原因，MTHFRC667T發生T等位基因突變后，使得MTHFR結構及功能異常，可介導DNA基因甲基化紊亂，而DNA甲基化作為人類精子發生過程中重要的調控機制之一，其紊亂可導致基因無法正確表達，引起精子發生障礙[13]。有文獻報道[14]，MTHFR缺乏雄性小鼠可檢出精子中印記基因甲基化紊亂，導致小鼠生精障礙及不育，該結論也間接支持本研究結果。

Hcy是甲硫氨酸循環代謝中間產物，MTHFRC667T表達為TT或CT型時，可引起5，10-亞甲基四氫葉酸向5-甲基四氫葉酸還原過程障礙，使得Hcy代謝中甲基減少，Hcy再甲基化生成甲硫氨酸也隨之下降，最終引起Hcy在體內堆積[15]。高Hcy具有細胞毒性，可通過介導氧自由基生成、精子氧化應激損傷、睪丸動脈血管硬化等機制參與少弱精子癥發生[16]。本研究顯示，研究組血清Hcy水平顯著高于對照組，且不同MTHFRC667T基因型患者血清Hcy水平差異顯著，表現為TT型>CT型>CC型。由此可見，MTHFRC667T基因多態性可能通過介導高Hcy血癥影響精液質量。DFI是反映精子DNA完整性的指標，其水平越高，提示精子DNA損傷越嚴重，精液質量也越差[17]。本文結果顯示，MTHFRC667T TT型、CT型精子總數、精子濃度、精子總活力、前向精子運動率較CC型下降，DFI水平升高，而Hcy水平與精子總數、精子濃度、精子總活力、前向精子運動率均呈負相關，與DFI呈正相關，提示MTHFRC667T基因多態性、Hcy水平均與精液質量有關，結合前文結果，也驗證了MTHFRC667T基因多態性通過影響Hcy水平來影響精液質量這一推論。本研究提示臨床，應重視少弱精子癥不育患者MTHFRC667T基因多態性及Hcy水平檢測，對高風險基因型、高Hcy水平男性可針對性予以相關干預如補充葉酸、核黃素等以降低Hcy水平，或許對提高患者精液質量有積極意義，值得進一步研究。

綜上所述，MTHFRC677T基因多態性與少弱精子癥男性不育有關，其中TT型、CT型是易感基因型，T等位基因是易感基因，其機制之一可能是通過高Hcy血癥途徑影響精液質量，導致男性不育。重視MTHFRC677T基因多態性相關檢測及針對性干預可能對少弱精子癥治療、實現優生優育有積極意義。