生長分化因子8調控女性生殖生理活動及生殖疾病相關分子機制的研究進展

劉博群，方蘭蘭

(鄭州大學第一附屬醫院生殖與遺傳專科醫院，鄭州 450052)

生長分化因子8(GDF-8)在全身各個組織廣泛分布且發揮著重要作用，其參與調節骨骼肌發育、脂類和蛋白質代謝。自從2012年首次報道血清GDF-8水平與PCOS患者腹部肥胖呈正相關[1]，此后，越來越多的研究關注于GDF-8在女性生殖系統中的作用和機理。GDF-8參與調控女性生殖生理過程，如卵泡發育、排卵、卵巢類固醇激素合成、胚胎著床及胎盤發育，同時，還參與生殖相關疾病的發生，如多囊卵巢綜合征(PCOS)[2]、子宮肌瘤[3]、先兆子癇[4]。此外，GDF-8還參與不孕癥患者妊娠結局的調控。本文將從GDF-8對卵泡發育、排卵、胎盤功能調控、女性生殖疾病調控和輔助生殖技術應用中的作用等方面進行綜述，以期為女性生殖生理機制的深入研究以及相關疾病診療新策略的提出提供重要科學依據。

一、GDF-8的概況

1.GDF-8的發現與結構：McPherron等[5]首次發現了轉化生長因子β(TGF-β)家族的新成員GDF-8，GDF-8敲除小鼠的肌肉量大約是野生型小鼠的2倍，鑒于GDF-8作用是抑制骨骼肌生長和分化，因此又被稱為肌肉生長抑制素(Myostatin)。隨后，在牛、羊、狗等物種中也發現GDF-8缺陷促使肌肉量增加[6]。Schuelke等[7]在患有肌肉肥大的患兒中發現了GDF-8突變，說明GDF-8在人體中同樣具有抑制骨骼肌生長的作用。

GDF-8屬于TGF-β超家族成員，由位于人類2號染色體長臂32.2位的MSTN基因編碼。最初合成的GDF-8前體蛋白大小為52 kDa，其具有N端分泌信號、前肽結構域和C端RSRR(Arg-Ser-Arg-Arg)蛋白水解位點，該前體蛋白需要經過兩次蛋白水解才能形成有活性的GDF-8[8]。成熟的GDF-8分子量為25.0 kDa，為二聚體分泌型多肽，在人類、小鼠、大鼠、豬、雞、火雞和狗中具有高度同源性。

2.GDF-8的受體和信號通路：TGF-β家族受體包含高親和力的Ⅱ型受體和低親和力的Ⅰ型受體，兩種受體亞型具有相似的結構和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。目前，已知有7種Ⅰ型受體，分別為激活素受體樣激酶1-7(ALK1-7)和5種Ⅱ型受體，分別為ACVR2A、ACVR2B、TβR2、BMPR2和AMHR2[9]。與GDF-8結合的Ⅰ型受體是ALK4和ALK5，與GDF-8結合的Ⅱ型受體是ACVR2A和ACVR2B[6]。

GDF-8可激活Smad依賴和Smad非依賴信號通路[8]。GDF-8與Ⅱ型受體結合激活Ⅰ型受體，磷酸化Smad2/3并與Smad4結合形成復合物調控核內靶基因，抑制性Smad7可消除GDF-8信號。此外，GDF-8還可以激活ERK、p38 MAPK和JNK等Smad非依賴信號通路[8]。

3.GDF-8在生殖系統中的表達：GDF-8及其受體在人卵巢中均有表達，且在顆粒細胞中的含量最高[10]，卵泡液中也可以檢測到GDF-8[11]。研究發現，GDF-8在人胎盤中的表達量隨孕周的增加而顯著下降[12]，在人子宮肌層和內膜中也有GDF-8及其受體的表達[13-14]，而人輸卵管中是否有GDF-8表達尚未有報道。

二、GDF-8參與生殖生理活動調控

1.GDF-8參與顆粒細胞增生：結締組織生長因子(CTGF)在人卵泡顆粒細胞中高表達，是卵泡膜細胞招募、卵泡發育和黃體血管形成過程中的關鍵蛋白[15]。Chang等[16]研究發現，GDF-8和CTGF顯著抑制人黃素化顆粒細胞(HGL)的增殖，GDF-8通過ALK 4/5介導的Smad 2/3信號通路上調CTGF的表達，該促進作用與GDF-8濃度呈正相關，此外，靶向敲除CTGF可以逆轉GDF-8對HGL細胞的抑制作用，從而證實了GDF-8對HGL細胞增殖負性調節作用的機制。

2.GDF-8對卵巢類固醇激素生成的調控作用：Cheewasopit等[17]研究發現，在牛顆粒細胞中GDF-8增加基礎芳香化酶(Aromatase)的表達和E2分泌，降低基礎和FSH誘導的3β-羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)的表達和孕酮分泌；在卵泡膜細胞中，GDF-8抑制基礎和LH刺激的雄激素分泌，而不影響孕酮分泌。我們團隊之前研究發現，在HGL細胞中GDF-8通過ALK5介導Smad2/3信號通路上調Aromatase的表達并增加E2水平[18]，增加FSH受體水平來增強FSH的效應。同時，GDF-8通過ALK5介導的Smad3和ERK1/2信號通路，下調類固醇急性調節蛋白(StAR)的表達并減少孕酮的產生。GDF-8通過減少LH受體水平來減弱LH的效應，且不影響細胞中P450側鏈切割酶和3β-HSD的表達。GDF-8通過抑制排卵前卵泡晚期孕酮的生成，在預防黃體過早形成發揮著關鍵作用，這一重要的生理功能用于維持卵泡生長和體細胞增殖[19-20]。GDF-8對HGL細胞類固醇激素合成的調控過程見圖1。

圖1 GDF-8對HGL細胞類固醇激素合成的調控過程示意圖

3.GDF-8參與卵丘擴張：正五聚體蛋白(PTX3)是PTX家族的經典蛋白，有聚合作用，參與形成穩定的透明質酸網絡，有助于細胞外基質組裝與卵丘擴張[21]。El-magd等[22]用腺相關病毒攜帶MSTN前肽(AAV-MSTNP)作為GDF-8抑制劑，發現在水牛卵母細胞體外成熟(IVM)中，AAV-MSTNP下調PTX3并抑制卵丘擴張。而我們研究證實，在人顆粒細胞中GDF-8通過ACVR2A/ACVR2B-ALK5介導的Smad信號通路下調PTX3的表達，抑制卵丘擴張，在排卵前減數分裂停滯后起著維持卵丘的作用[11]。

4.GDF-8與卵母細胞成熟：在豬卵母細胞IVM中，培養基補充GDF-8會激活P38 MAPK信號通路從而改變卵母細胞成熟相關基因的轉錄水平，使細胞內ROS水平下降，促進卵母細胞成熟[23]。之后研究者還發現，GDF-8也可以通過Smad2/3信號通路促進減數分裂和細胞質成熟[24]。在水牛卵母細胞IVM中，通過觀察卵母細胞IVM效率和卵丘-卵母細胞復合體中特異性基因的表達情況發現，GDF-8抑制劑可顯著降低卵母細胞的成熟率，使達到減數分裂中期的卵母細胞減少，并伴隨著相關凋亡基因的表達上調，抗凋亡基因的表達下調[22]。在人卵巢中GDF-8可以促進顆粒細胞賴氨酸氧化酶(LOX)的表達及活性[25]，而LOX在卵泡發育過程中可以穩定細胞外基質，是優質卵母細胞的標志物[26]，提示GDF-8參與促進卵母細胞成熟。

5.GDF-8參與調控胚胎發育：Yoon等[27]研究發現，在豬胚胎體外培養中外源性GDF-8通過改變基因的轉錄模式，從而增強內細胞團標記物SOX2的表達和內細胞團/滋養外胚層比例以提高體外受精中的囊胚質量。El-magd等[22]研究表明，GDF-8抑制劑作用于體外培養的水牛卵母細胞后，其受精效率、卵裂率和囊胚率顯著下降。此外，Wong等[28]研究發現，GDF-8可以促進金倉鼠體外培養的胚胎滋養層的增殖與孵化、抑制附著，其抑制附著是通過干擾胚胎著床蛋白酶表達或減弱子宮內膜上皮細胞產生的白血病抑制因子發揮作用的。因此，GDF-8參與植入前胚胎發育過程，而GDF-8在人體胚胎調控中的作用尚無研究。

6.GDF-8參與調控胎盤功能：Peiris等[29]用不同濃度的GDF-8處理人原代絨毛膜滋養層細胞(EVT)及其細胞系(HTR-8/Svneo)發現，GDF-8促進EVT和HTR-8的增殖與遷移，EVT和HTR-8的增殖與GDF-8劑量相關，而遷徙無劑量依賴性。GDF-8在調控滋養層細胞侵襲中的作用尚有爭議。卵泡抑制素樣3(FSTL3)是GDF-8拮抗劑[30]，可顯著促進滋養層的侵襲和脂質儲存，抑制滋養層的凋亡，而研究發現，GDF-8通過ALK5-Smad2/3信號通路上調FSTL3的表達并促進滋養層細胞侵襲[31-32]。Mitchell等[12]通過體外放射標記脫氧葡萄糖評估胎盤組織葡萄糖攝取發現，GDF-8促進人胎盤組織的葡萄糖代謝，有助于胎盤葡萄糖穩態，可能是治療胎盤功能不全、妊娠糖尿病等疾病的靶點。Antony等[33]研究發現，GDF-8抑制絨毛膜癌細胞系(BeWo細胞)的葡萄糖攝取。以上兩項研究結果的差異可能由于原代滋養細胞和細胞系在基因表達、甲基化模式和HLA分子表達方面存在差異。

三、GDF-8參與的女性生殖疾病

1.多囊卵巢綜合征(PCOS)：PCOS是不孕癥患者最常見的原因之一，其鹿特丹診斷標準[34]為稀發排卵或無排卵、臨床/生化高雄激素血癥、多囊卵巢的超聲表現，滿足兩個及以上者即可診斷。研究發現，PCOS患者卵巢竇卵泡中GDF-8及其受體水平增加[10]，卵泡液中GDF-8水平較高[2]，而血清GDF-8水平無顯著變化[1，35]。有研究發現，PCOS患者卵泡液GDF-8表達水平高于血清，說明其作為卵巢源性因子參與PCOS的發生[2]。Bai等[36]研究發現，在PCOS患者中GDF-8通過ALK5介導的Smad2/3信號通路上調人纖溶酶原激活物抑制劑1(SERPINE1)的表達，從而對顆粒細胞造成葡萄糖代謝損傷，并使得PCOS患者代謝紊亂。

2.卵巢癌：在卵巢癌中E-鈣黏蛋白(E-cadherin)下調參與上皮間充質轉化(EMT)過程，即上皮細胞失去粘附而獲得遷移和侵襲特性[37]。Zhao等[38]研究發現，GDF-8激活ALK4/5-Smad2/3信號通路下調E-cadherin的表達，上調EMT的重要轉錄因子Snail和Slug的表達，參與卵巢癌細胞的擴散轉移。

3.子宮肌瘤：子宮平滑肌瘤是女性最常見的良性腫瘤。研究發現，GDF-8在人類平滑肌瘤中較正常子宮肌細胞表達升高[39]。Islam等[3]用GDF-8處理子宮原代肌層細胞和肌瘤細胞后發現，GDF-8通過激活Smad2/3信號通路降低子宮肌層細胞增殖細胞核抗原和Ki-67表達，發揮抗纖維化的作用，而不影響肌瘤細胞的增殖，有可能為子宮肌瘤分子診療措施的提出提供依據。

4.子宮腺肌癥：子宮腺肌癥好發于絕經前婦女，主要癥狀有異常子宮出血(AUB)，低生育能力和較高的流產率[40]。研究發現，GDF-8及其Ⅱ型受體在子宮腺肌癥中高表達，推測GDF-8受體擴增可能在腺肌癥導致的不孕中發揮作用[41]。Harmsen等[42]研究發現，腺肌癥組患者GDF-8的表達水平高于對照組，這提示GDF-8參與子宮脆性和滲透性較高血管的生成過程，可能與腺肌病相關的AUB和生育能力低下有關，為該疾病提供了一個可能的治療靶點。

5.子宮內膜腫瘤：GDF-8及其受體在正常子宮內膜以及內膜良惡性腫瘤中表達存在差異。GDF-8及受體在良性腫瘤，如卵巢子宮內膜瘤(OMA)和子宮內膜息肉中表達升高。GDF-8在深浸潤性子宮內膜異位癥(DIE)和子宮內膜癌中表達最高，而GDF-8受體在子宮內膜癌和腺癌中的表達最高。GDF-8及其受體的這種差異性分布提示，GDF-8參與了人類子宮內膜相關病理[14]，但為了更好地理解GDF-8及其相關蛋白在子宮內膜生理和病理中的作用，還需要進一步的研究。

6.妊娠期糖尿病(GDM)：GDM是指妊娠期母體葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗。Peiris等[43]研究發現，GDM患者血清GDF-8水平與正常妊娠組相比無顯著差異，而胎盤中GDM患者GDF-8水平顯著低于正常妊娠組。經胰島素治療組患者胎盤GDF-8水平高于飲食療法組，更接近正常對照組。由此，Peiris等[43]提出，GDF-8于胎盤組織的表達在應激條件下(如糖代謝異常)發生改變，通過影響胎盤組織葡萄糖穩態，改變胎盤的功能，可能與GDM的葡萄糖耐受不良相關。

7.子癇前期(PE)和宮內生長受限(IUGR)：PE和IUGR是導致母體、胎兒和新生兒預后不良的主要妊娠疾病。研究證實，GDF-8在PE、IUGR以及PE合并IUGR孕婦血清和胎盤中顯著升高[4]。在體外培養胎盤組織中，GDF-8治療促使妊娠早期胎盤組織產生的細胞因子發生改變，即從Th1細胞因子(促炎)環境轉移到成功妊娠所需的Th2細胞因子(抗炎)環境，說明GDF-8在合并PE和IUGR的復雜妊娠中發揮有利作用[4]。

四、GDF-8在輔助生殖中的作用

研究發現，在接受IVF助孕患者控制性超促排卵(COH)過程中，妊娠組與非妊娠組血清GDF-8水平動態變化趨勢相似，但在HCG日和ET后14 d血清GDF-8水平有顯著差異，提示血清GDF-8水平與妊娠結果關系密切[44]。目前，已知HCG日孕酮提前升高可以降低胚胎著床率、妊娠率和活產率，且血清GDF-8水平與孕酮水平呈負相關[19，45]。由此，我們推測GDF-8變化預測妊娠結局的主要機制為：在HCG使用前，較高水平的GDF-8通過保持較低的血清孕酮水平對妊娠有利；而HCG作用后，低水平的GDF-8維持高水平的孕酮對早期胚胎著床至關重要，因此，血清GDF-8水平是IVF/ICSI-ET治療患者妊娠的一個有價值的預測因子[44]。

另外，在IVF過程中PCOS患者卵泡液GDF-8水平顯著高于非PCOS患者，顆粒細胞中基礎ALK5水平增加，而StAR水平降低，且GDF-8對StAR的抑制作用更加顯著[2]。GDF-8和ALK5的高基礎表達水平可能導致PCOS患者顆粒細胞中StAR和孕酮異常下調，這可能導致不良的妊娠結局。相比之下，在非PCOS患者中，通過保持相對較低StAR和孕酮水平以防止過早黃素化，較高水平的GDF-8可能對妊娠有益，因此，GDF-8在PCOS患者卵泡液中的異常表達可能是治療PCOS的潛在新靶點[2]。

五、總結

綜上所述，GDF-8廣泛參與卵泡發育、排卵、胎盤功能及生殖疾病調控過程，且在輔助生殖技術助孕患者妊娠調控中具有重要作用，但其在人體胚胎發育的作用以及不孕相關疾病發生的分子機制仍有待深入研究，在此基礎上進一步探索女性生殖障礙疾病的新型分子靶標和診療措施。