玉米bZIP基因應答逆境脅迫的表達模式分析

賈利強，劉 訊，丁 波

(貴州師范學院，貴州 貴陽 550018)

轉錄因子在調控植物生長發育及抵御逆境脅迫等進程中發揮著重要的作用[1]。植物轉錄因子家族可劃分為60多個，作為成員最多、分布最廣的轉錄因子家族之一，bZIP基因家族成員在植物的生長發育、逆境脅迫及激素信號轉導和光形態建成等方面發揮著重要的作用[2]。bZIP蛋白含有保守的bZIP結構域，由N端保守的結合下游核酸序列的堿性結構域和起二聚體化作用的亮氨酸拉鏈結構域組成[1]。此外，bZIP轉錄因子一般還含有一個或多個轉錄激活結構域，以促進所結合的下游基因的表達[2]。bZIP作為真核生物一大類轉錄因子家族成員，在不同的物種中，其數目差異比較大。擬南芥基因組編碼75個成員，根據進化樹分析結果，可以劃分為10個亞家族[3-4]。隨著植物基因組計劃的開展，陸續有更多植物的bZIP家族成員被報道，包括玉米[5]、水稻[6]、黃瓜[7]、葡萄[8]、芝麻[9]、薺麥[10]、蘿卜[11]、馬鈴薯[12]、橄欖[13]、紅花[14]和紅棗[15]等。

bZIP轉錄因子參與調控諸多植物生長發育及應答逆境脅迫響應途徑，諸如鹽脅迫、干旱脅迫、溫度脅迫、營養脅迫等[16]。HY5是bZIP轉錄因子家族中的成員，是調控植物生長發育的關鍵因子，可以調控植物激素代謝平衡及信號轉導途徑，進而影響植物的光形態建成以及避陰反應[17]，還參與調控氮素信號途徑中的關鍵基因NIA2和NIR1以及氮素吸收基因NRT1.1和AMT1；2[18]，進而影響營養物質諸如氮、磷和鉀的吸收，HY5同時還抑制擬南芥根系的生長發育以及莖的伸長[1]。AtbZIP53參與調控擬南芥種子休眠相關基因的表達[2]。FD，bZIP轉錄因子成員，調控控制開花關鍵基因FT的表達和植物的開花[16]。bZIP轉錄因子DRINK ME表達的改變影響擬南芥的生長及生殖發育[2，4，19]以及無芒隱子草的開花[20]。ZmbZIP4通過根系激素的變化來調控根系的發育[21]，而毛白楊bZIP53通過調控根系中IAA代謝平衡，間接調控側根生長發育，進而影響到其抗逆性能[22]。總之，植物bZIP基因通過直接調控生長發育關鍵因子或者激素和營養代謝平衡來廣泛地影響植物生長發育進程。

植物bZIP蛋白廣泛參與各種逆境脅迫。在擬南芥中，多個AtbZIP基因和其抗逆性相關。超表達AtbZIP1提高抗鹽和抗旱性[23]，AtABF3能全面地提高擬南芥抗溫度脅迫、抗氧化和抗旱能力[24]，然而，AtbZIP24負調控其抗鹽性能[25]，AtbZIP62受干旱脅迫的強烈誘導，超表達該基因能提高擬南芥的抗旱性[26]。水稻超表達OsZIP23和OsZIP71能顯著提高其抗旱和抗鹽性能[27-28]，然而，OsbZIP52負調控水稻的抗鹽抗旱性能[29]。超表達馬鈴薯StbZIP65株系也能提高其抗鹽性[30]。小麥TabZIP60在擬南芥中超表達表現為多抗性狀[31]。大豆GmbZIP19在擬南芥中也表現出抗性的改變，通過上調ABA、JA和SA等相關激素途徑基因的表達水平，提高對多種病菌的抗性，然而對非生物脅迫，諸如干旱和高鹽脅迫表現為抗性降低[32]。擬南芥bZIP基因家族中的A亞家族成員參與調控眾多逆境脅迫，超表達AREB1/ABF2能顯著地增加擬南芥綜合抗逆能力[33]。而ABF3/AREB2/ABF4超表達株系能提升其抗旱性能[34]。ZmbZIP4通過調控ABA的代謝平衡進而影響其抗逆性能[21]。這些數據都表明，bZIP基因和植物的抗逆性密切相關。

玉米(ZeamaysL.)是世界栽培面積和產量最大的糧經飼兼用的大宗作物，在保障世界糧食安全中發揮著舉足輕重的作用。然而隨著生態環境的不斷惡化，土壤鹽漬化和貧瘠化、氣候干燥和低端溫度的頻繁出現，都嚴重制約玉米的高產穩產。因此，探究玉米抵御各種逆境脅迫因子的分子機制，挖掘各類抗逆基因，解析抗逆分子生理生化機制，對于培育突破性的玉米新品種和開發具有重大利益價值的分子標記具有理論和現實的重大意義。不同玉米自交系抗逆能力差異明顯，昌7-2對鹽脅迫敏感、而鄭58具有較強的抗鹽脅迫能力[35]。許多研究表明，鄭58自交系具有較強的綜合抗性[36-39]。bZIP轉錄因子對植物逆境脅迫響應具有多重調控作用，已在玉米研究中受到廣泛關注[5，21-22，30，40]。

根據前人的研究結果，本試驗選取玉米bZIP基因家族中的一個亞家族，包含9個玉米bZIP基因，系統地研究了其在玉米不同組織器官中以及應答不同逆境脅迫的表達模式，以其為未來解析玉米響應外界環境脅迫機制、培育抗逆玉米新品種提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料是玉米骨干自交系鄭58，保存于中國熱帶農業科學院玉米中心。鄭58自交系種植于中國熱帶農業科學院玉米育種基地(廣東湛江)，揚花授粉期，采集玉米的根系、莖、葉、雄花和授粉14 d的幼穗等組織器官，液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 非生物脅迫條件下的表達模式分析 玉米鄭58自交系種子經5%次氯酸鈉溶液表面消毒5 min，28 ℃黑暗催芽，選取催芽一致的種子置于網紗上，生長于在Holland營養液中，生長條件為長日照(16 h光照，28 ℃；8 h黑暗，25 ℃；相對濕度70%)。玉米幼苗生長至三葉一心期時，取生長狀態相同的植株分別進行脅迫處理，即干旱或鹽脅迫處理，將玉米幼苗轉移到20%的PEG 6000溶液或200 mmol/L的NaCl溶液中；缺氮脅迫處理，將玉米幼苗轉移至銨態氮或硝態氮缺乏的Holland營養液中；低溫處理，將玉米幼苗置于4 ℃環境中。在脅迫處理的0，1，6，24 h時取葉片樣品，液氮速凍，保持-80 ℃冰箱備用。3株幼苗混樣作為1次生物學重復，設置3次生物學重復。

1.2.2 RNA提取及定量PCR 采用TRIzol法提取玉米總RNA，利用DNase Ⅰ去除gDNA污染，用1%的瓊脂糖凝膠和NanoDrop分布檢測RNA的完整性和純度，反轉錄cDNA，進行熒光定量PCR分析。葉片總RNA提取試劑盒、DNase Ⅰ和反轉錄試劑盒均購于寶生生物工程(大連)有限公司。將反轉錄所得cDNA稀釋至濃度為100 μg/μL作為擴增模板，以玉米的ACTIN作為內參基因，設計目的基因的特異性引物(表1)。使用熒光染料SYBR Premix EXTaqTM kit(Roche，Mannheim，Germany)在Roche Light Cycler 480 System(Roche，Basel，Switzerland)儀器上進行定量PCR反應。10 μL反應體系：SYBR Premix EXTaqTM kit 5 μL、上下游引物各1 μL(100 μmol/L)、cDNA 1 μL(50 ng/μL)、ddH2O 2 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性 2 min；95 ℃變性 5 s，55 ℃退火 5 s，72 ℃延伸25 s，45個循環。3次重復，反應結束后按照2-ΔΔCt算法計算基因的相對表達量。每個處理3次生物學重復，每個生物學重復3次技術重復。

表1 ZmbZIP基因的實時熒光定量引物Tab.1 qRT-PCR primers for expression on analysis of ZmbZIPs gene

1.2.3 bZIP生物信息學分析 研究中所用到的基因、蛋白和CDS序列來源于Phytozome v9.1數據庫(http：//www.phytozome.net/)和MaizeGDB(Maize Genetics and Genomics Database)數據庫(http：//www.maizedb.org/)。9個ZmbZIP蛋白的分子量大小和理論等電點利用在線工具ExPASy(http：//expasy.org/tools/protparam.html)進行預測。從玉米基因組注釋信息中獲取bZIP基因家族成員的染色體定位信息，利用Mapinspect繪制其在染色體上的分布(http：//www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-mapinspect.html)。9個ZmbZIP和78個擬南芥AtbZIP蛋白序列組成的數據矩陣用來進行進化樹分析。利用在線軟件MAFFT進行多重序列聯配比對分析，去除非保守蛋白序列，利用MEGA X對保守的蛋白序列進行進化樹分析，采用鄰接(Neighbor-Joining，NJ)算法構建系統進化樹，參數設置為缺失數據選擇Pairwise Deletion，使用的模型為P-distance，Bootstrap校檢次數設置為1 000次。使用在線工具GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)預測ZmbZIP的基因結構。

2 結果與分析

2.1 ZmbZIP生物信息學分析

根據Wei等[5]的報道，選擇了玉米bZIP基因家族中的E亞家族成員，共計9個玉米bZIP基因作為本試驗的研究對象(表2)。9個ZmbZIP蛋白大小為180(ZmbZIP49)～349 aa(ZmbZIP53)，對應的分子質量變化為20.04(ZmbZIP49)～38.56 ku(ZmbZIP53)，預測的理論等電點的變化為5.96(ZmbZIP79)～10.29(ZmbZIP49)，其中ZmbZIP79最小，顯示出較弱的溶解度和更強的沉淀能力，而ZmbZIP49分子間相對作用力較大，推測沉降系數較低。依據ZmbZIP基因在基因組中的物理距離等信息，將9個基因定位于4條染色體上，即Chr3、Chr4、Chr5和Chr8，分別含有3，3，2，1個基因(圖1-A)。9個ZmbZIP基因的內含子數目保守，均呈現外顯子開頭和結尾的特殊結構，其中5個基因含有3個內含子，4個基因含有4個內含子(圖1-B)。9個ZmbZIP蛋白的N端含有高度保守的bZIP結構域，包括保守的堿性蛋白序列(Basic region)和亮氨酸拉鏈序列(Leucine zipper)(圖1-C)。這9個ZmbZIP蛋白和4個擬南芥AtbZIP蛋白聚合為一個亞家族，表明它們是從共同的祖先bZIP基因進化而來。9個ZmbZIP成員可以進一步劃分為3個亞組，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，各包含5，2，2個成員，這3個亞組的成員之間同源性較高，推測其功能存在冗余。

A. ZmbZIP基因的染色體定位；B.ZmbZIP的基因結構分析；C.保守的ZmbZIP結構域多重序列比對；D.ZmbZIP蛋白的進化樹分析。A.Chromosomal distribution of ZmbZIPs；B.Gene structure analysis of ZmbZIPs；C.Multiple sequence alignment of conserved ZmbZIPs domain；D.The phylogenetic tree analysis of ZmbZIPs.

2.2 ZmbZIP基因在玉米不同組織中的表達模式分析

在玉米授粉揚花期，采集玉米根、莖、葉、雄花和授粉15 d的幼穗等不同組織器官的cDNA為模板，以玉米ACTIN基因為內參(表1)，進行實時熒光定量PCR，檢測9個ZmbZIP基因在玉米不同組織器官中的表達模式。以根中的表達量作為參照，對其他部位的表達量進行了均一化處理。由圖2可知，9個ZmbZIP基因在不同組織器官中的表達模式不同。ZmbZIP80沒有被檢測到，可能是由于非常低的表達量或者有特異的時空表達模式；ZmbZIP42和ZmbZIP49在根部的表達量比其他組織器官要高2倍以上，ZmbZIP37、ZmbZIP56和ZmbZIP121主要在2個組織器官中(根和穗)表達，而ZmbZIP53、ZmbZIP65和ZmbZIP79主要在3個組織器官中表達。玉米ZmbZIP基因的表達模式分析預示著9個ZmbZIP基因在玉米不同組織器官中呈現不同功能。

表2 玉米ZmbZIP蛋白的理化性質分析Tab.2 The physical and chemical properties analyses of ZmbZIPs in maize

2.3 ZmbZIP基因應答逆境脅迫時的表達模式分析

植物bZIP基因廣泛地參與調控植物響應逆境脅迫，為了探測本研究中的ZmbZIP基因應答鹽、干旱和低溫等逆境脅迫時的表達模式，設置200 mmol/L NaCl、20%PEG6000和4 ℃等模擬脅迫條件，利用qPCR技術探測了這9個基因的表達模式，由圖3可知，所檢測到的7個ZmbZIP基因在應對3種不同的逆境脅迫時的表達模式不同。ZmbZIP37和ZmbZIP53的表達明顯受到NaCl脅迫的誘導，分別比脅迫處理前高4倍和2倍以上；而ZmbZIP49和ZmbZIP79受到NaCl脅迫的明顯抑制，比脅迫處理前降低了至少50%以上；ZmbZIP37、ZmbZIP49和ZmbZIP121的表達受到20% PEG6000的抑制，表達量比脅迫處理前下降了至少50%。低溫脅迫對7個基因的表達量的影響有限，沒有發生2倍以上的變化，預示著這些基因在應答低溫脅迫時的作用與鹽、干旱脅迫時的分子機制可能存在很大差異。這些表達數據為進一步分析這些基因的生物學功能提供了有價值的科學數據。

不同小寫字母代表差異性顯著(P<0.05)。圖3-5同。Different small letters indicates significant difference among treatments at 0.05 level.The same as Fig.3-5.

圖3 ZmbZIP應答不同逆境脅迫時的表達模式分析Fig.3 The expression pattern of ZmbZIPs under 200 mmol/L NaCl，20% PEG6000 and 4 ℃ stress

2.4 葉片中ZmbZIP基因應答不同氮形態缺乏脅迫時的差異表達分析

由圖4可知，硝態氮和銨態氮缺乏脅迫對ZmbZIP基因的表達水平影響比較大。硝態氮缺乏脅迫明顯抑制ZmbZIP37和ZmbZIP53基因的表達，在脅迫處理24 h，其表達量分別比處理前降低了約71%和78%，而銨態氮對這2個基因的抑制作用不明顯，表明這2個基因參與玉米應答硝態氮缺乏脅迫途徑。ZmbZIP42和ZmbZIP49在2種脅迫方式處理1 h，這2個基因的表達都受到誘導而上調，之后在硝態氮缺乏脅迫下，這2個基因的表達迅速下降，在脅迫處理24 h，其表達量比處理前分別下降了85%和90%，而銨態氮缺乏脅迫持續地誘導這2個基因的表達上調，在脅迫處理24 h，其表達量分別上調了17，13倍，表明這2個基因都是硝態氮或銨態氮脅迫的早期響應基因，但其參與調控硝態氮缺乏脅迫或銨態氮缺乏脅迫的機制不同。ZmbZIP56受這2種脅迫處理后的表達模式類似，都是先升后降，硝態氮或銨態氮缺乏脅迫處理分別在6，1 h，其表達量達到最大值，之后出現下降，顯示該基因在參與這2種脅迫響應機制中可能存在類似的功能。ZmbZIP65和ZmbZIP79的表達模式受硝態氮缺乏脅迫和銨態氮缺乏脅迫處理的影響不同，ZmbZIP65的表達受硝態氮缺乏脅迫的抑制，而在銨態氮缺乏脅迫處理下，其表達先上升，比處理前高出10倍，之后迅速下降，與之相反，ZmbZIP79的表達一直受到銨態氮缺乏脅迫的抑制，而受硝態氮缺乏脅迫的明顯誘導，在硝態氮缺乏脅迫處理6 h，其表達量比處理前高出了13倍，之后又出現下降。ZmbZIP121則受2種脅迫處理的明顯抑制。這些數據表明，這8個ZmbZIP基因廣泛地受到氮缺乏脅迫的影響，表明這8個ZmbZIP基因在氮缺乏脅迫中的廣泛作用。

圖4 玉米葉片中的ZmbZIP應答不同氮形態缺乏脅迫的響應表達模式Fig.4 The expression pattern of ZmbZIPs of leaves in response to nitrogen stress in maize

2.5 根系中ZmbZIP基因應答不同氮形態缺乏脅迫時的表達模式分析

由圖5可知，玉米根系中8個ZmbZIP的表達受不同氮形態缺乏脅迫的影響。ZmbZIP42、ZmbZIP49、ZmbZIP65和ZmbZIP121的表達明顯受硝態氮缺乏脅迫的誘導，并且都在脅迫處理1 h，表達量

圖5 玉米根系中的ZmbZIP在不同逆境脅迫時的表達模式分析Fig.5 The expression pattern of ZmbZIPs of roots in response to nitrogen stress in maize

明顯上升，達到最高或次高水平，之后出現回落，甚至明顯受到抑制，在脅迫處理24 h，ZmbZIP42和ZmbZIP49表達水平下降了90%，銨態氮缺乏脅迫對ZmbZIP49基因的影響類似，在脅迫處理1 h，表達量達到最高值，之后出現回落，而銨態氮缺乏脅迫一直抑制ZmbZIP65和ZmbZIP121的表達，表明這4個基因在應對不同氮形態缺乏脅迫時呈現不同的表達模式。ZmbZIP56和ZmbZIP79的表達一直受到2種脅迫處理的抑制，表明這2個基因在玉米抵御不同氮脅迫時可能發揮著類似的作用。ZmbZIP37和ZmbZIP53強烈受到銨態氮缺乏脅迫的誘導，這2個基因表達的最高值分別比處理前高出39倍和13倍，表明這2個基因在銨態氮缺乏脅迫中的重要作用。

3 結論與討論

bZIP基因家族是真核生物中廣泛存在的一大類轉錄因子家族，在生物的生長發育進程中發揮著重要的調控作用。bZIP基因家族含有保守的bZIP結構域，調控目的基因的表達。除了保守的bZIP結構域外，其他區域不同物種中具有較大的差異。調控植物應答逆境脅迫響應途徑是bZIP轉錄因子的主要功能之一。本研究通過人為模擬試驗，系統地研究了9個基因應答200 mmol/L NaCl、20% PEG6000、4 ℃低溫和硝態氮/銨態氮缺乏脅迫時的表達模式，部分研究結果與前人的一致，比如，在B73和鄭58中，ZmbZIP49同時受到干旱和低溫脅迫抑制，顯示了該基因在應答干旱和低溫脅迫時具有類似的生物學功能，而在應答鹽脅迫時，ZmbZIP49在B73中明顯上調，在鄭58中受到明顯抑制，表明該基因在應答鹽脅迫時在不同品種呈現不同功能。ZmbZIP42和ZmbZIP53受鹽脅迫的誘導，其中后者顯著受鹽脅迫誘導，脅迫處理6 h，其表達量比處理前上升了超過2倍，這與以渝 882自交系作為試驗材料的研究結果一致[27]，表明了該基因受鹽脅迫誘導而上調這一表達模式在不同種質資源中具有共性，預示著其功能在調控玉米應答鹽脅迫響應途徑中的保守性，同時進化樹分析結果表明，這2個基因親緣關系非常近，無論是基因序列、蛋白結構上的高度一致性，還是受鹽脅迫誘導表達模式的相似性，都表明這2個基因在調控玉米應答鹽脅迫途徑中可能具有功能冗余性或者一起形成蛋白復合體行使功能，這在許多研究中都有報道，蘋果C/S1bZIP家族成員抑制MdIPT5b基因的表達，進而影響其抗旱能力，單個bZIP成員不具有此功能，唯幾個bZIP成員組成異源二聚體才具備調控下游基因的功能[41]。

綜上所述，本研究選取了9個玉米bZIP基因作為研究對象，以玉米自交系鄭58作為試驗材料，系統地研究了玉米bZIP在應答各類逆境脅迫因子的表達模式，為將來深入研究這些基因的生物學功能提供了有價值的參考數據，同時，可以進一步加深理解玉米骨干自交系鄭58綜合抗性好的分子生理機制。