利用秈粳交RIL群體進行水稻發芽期與芽期耐冷性QTL分析

陳子琪，王偉蘋，趙宏強，王 皓，韓 笑，楊洛淼，辛 威，劉化龍，鄭洪亮，王敬國

(東北農業大學，寒地糧食作物種質創新與生理生態教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

水稻起源于熱帶和亞熱帶地區，是我國三大糧食作物之一[1]。與其他糧食作物相比，水稻對低溫變化更為敏感[2]。黑龍江省作為我國優質粳稻的主產區，是保證我國糧食安全的“壓艙石”[3]。然而，東北地區每隔3～4 a就會發生一次低溫冷害，導致糧食減產約50億kg[4]，嚴重危害了我國糧食安全[5]。黑龍江春季頻發的倒春寒，嚴重影響著水稻發芽期和芽期的生長。近些年來，隨著水稻市場價格逐年下降，人工成本不斷增加，直播作為一種輕簡化的栽培方式，在水稻生產上的應用面積逐年增加[6]。直播栽培經常遭受發芽期和芽期的低溫，導致種子活力下降，發芽率降低，發芽慢，出苗不整齊，嚴重影響了水稻后期的生長，致使水稻產量大幅降低[7]。因此，定位水稻發芽期和芽期耐冷相關QTL，挖掘耐冷相關基因，對于耐冷性育種和直播稻生產具有重要意義。

水稻的耐冷性是由多基因控制的復雜數量性狀。不同研究人員利用不同群體、結合關聯分析和連鎖分析，對發芽期和芽期耐冷性QTL進行了定位。其中，發芽期耐冷性鑒定指標大多以發芽率為主。侯名語[8]鑒定了521份水稻品種的低溫發芽力，發現秈稻的低溫發芽力高于粳稻品種，并利用USSR5/N22衍生的F2群體在第2，6，7，11，12號染色體上檢測到5個與低溫發芽率相關的QTL。Schl?ppi等[9]利用202個水稻品種組成的自然群體為試驗材料，在第1，6，7，9，10，12號染色體上共檢測到6個與水稻低溫發芽率相關的QTL。姜旋等[10]利用粳秈交構建的RIL群體，檢測到7個水稻發芽期耐冷QTL，分別位于水稻1，3，5，6，8號染色體上，表型貢獻率為5%～16%。紀素蘭等[11]利用Kinmaze和DV85雜交衍生的重組自交系群體，檢測到11個與低溫發芽力相關的QTL，其中qLTG-7和qLTG-11的表型貢獻率均最大(27.93%)。張所兵等[12]利用扎西瑪/南粳46雜交衍生的RIL群體定位了3個低溫發芽率QTL，位于第2，4，7號染色體上，可解釋7.69%～22.93%的表型變異。姚曉云等[13]利用耐冷型粳稻龍稻5號和冷敏感型秈稻中優早8構建RIL群體，分別在自然低溫和人工低溫環境下各定位到5個相關的QTL，位于第2，3，7，8，11，12號染色體上。滕勝等[14]利用秈粳交構建的DH群體，在4，9號染色體定位到2個與低溫發芽力相關的QTL。朱金燕等[15]以秈稻品種廣陸矮4號為受體親本、粳稻品種日本晴為供體親本構建的染色體單片段代換系為試驗材料，檢測到20個低溫發芽率QTL，分布在第1，2，3，5，6，9，11，12號染色體上。水稻芽期耐冷性評價指標主要包括損傷程度、成苗率、死苗率等。Zhang等[16]利用包含249個水稻品種組成的自然群體，以損傷程度和存活率為指標，在5 ℃低溫處理下共定位到13個芽期耐冷相關QTL。張露霞[17]利用Asominori/IR24構建的RIL群體，在5 ℃低溫處理下以死苗率為指標，檢測到3個芽期耐冷性QTL，分別位于第5號和第12號染色體上，可解釋12.00%～19.21%的表型變異。Baruah等[18]利用A58/W107構建RIL群體，檢測到3個芽期耐冷相關QTL，分別位于1，11，12號染色體上。

綜上所述，不同學者對水稻發芽期和芽期耐冷性進行的研究，所選擇的遺傳群體、試驗方法和鑒定指標存在較大差異，定位到的QTL及其表型貢獻率也多有不同，而且很少利用同一群體同時進行發芽期和芽期耐冷QTL定位。本研究利用耐冷性強的粳稻品種彩稻為母本和耐冷性弱的秈稻品種WD為父本雜交衍生的含有189個株系的RIL群體為試驗材料，結合高密度遺傳連鎖圖譜，對發芽期和芽期耐冷性進行QTL分析，以期發現控制水稻發芽期和芽期耐冷性的QTL，從而為水稻耐冷性的遺傳改良提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究以粳稻品種彩稻為母本、秈稻品種WD為父本雜交衍生的含有189個株系的RIL群體為試驗材料。

1.2 遺傳圖譜的構建

利用試劑盒提取雙親及RIL群體的DNA，將提取的DNA送至博睿迪生物公司進行10K Array基因芯片分析，去除冗余標記后，把基因型相同且連續的單核苷酸多態性標記記為一個Bin標記。將與親本彩稻基因型相同的Marker標記為“a”，與親本WD基因型相同的Marker標記為“b”，將其他基因型的Marker標記為“-”，以此為基礎，運用JoinMap 4.0軟件構建該RIL群體的遺傳圖譜。

1.3 發芽期耐冷性鑒定

發芽期耐冷性鑒定參考李太貴[19]的方法進行，并稍加改動。將種子放入48 ℃恒溫干燥箱中高溫處理48 h，使其充分干燥并打破休眠。分別選取2個親本及RIL群體各株系打破休眠后的100粒飽滿種子，放入墊有一層濾紙的培養皿中，用1%的次氯酸鈉浸種消毒30 min，用蒸餾水沖洗2～3遍后加入適量蒸餾水，放入13 ℃恒溫培養箱中進行低溫處理。以胚芽鞘的出現作為種子萌發標準[20]，逐日記錄每天發芽數，直至連續3 d發芽數為0。同樣數量的種子，經過相同的處理后，放入26 ℃的恒溫培養箱中正常培養，作為對照。試驗設置3次重復。以相對發芽率和處理的平均發芽天數作為表型鑒定指標[21]。

1.4 芽期耐冷性鑒定

芽期耐冷性鑒定參考韓龍植等[22]的方法進行，并稍加改動。從親本及RIL群體各株系中分別選取100粒飽滿種子，放于墊有濾紙的培養皿中，待種子芽長5～8 mm時選取48粒長勢一致的種子放于剪好孔的PCR板中。加入適量蒸餾水后放在3 ℃培養箱中處理10 d，再置于26 ℃光照培養箱中恢復正常生長7 d，調查成苗率。并按照姜樹坤等[23]的方法將秧苗的恢復狀態劃分為5個級別(表1)。試驗設置3次重復。

耐冷級別=(0×0級的株數+1×1級的株數+2×2級的株數+3×3級的株數+4×4級的株數)/處理的材料總株數。

表1 芽期耐冷性評價標準Tab.1 Evaluation standard of cold tolerance at bud stage

1.5 QTL分析

運用IciMapping 4.2軟件進行QTL定位，LOD值≥2.5即認為該區間存在一個加性QTL，LOD值≥5.0即認為該區間存在一個上位性QTL，并計算QTL的加性效應、上位性效應及表型貢獻率。QTL的命名原則參照McCouch等[24]的方法。

2 結果與分析

2.1 遺傳連鎖圖譜構建

雙親及RIL群體經10K芯片分析共得到了3 041個SNPs，利用IciMapping 4.2的Bin模塊去除冗余標記后獲得了978個Bin標記，最終利用JoinMap 4.0構建了全長2 465.33 cM的遺傳連鎖圖譜，標記間距離平均值為2.52 cM(圖1僅展示部分)。其中，9號染色體上標記數最少(49個)，11號染色體上標記數最多(140個)。標記間平均距離最小值與最大值分別為1.64，4.31 cM，分別位于11號染色體和3號染色體上(表2)。

圖中數據單位為cM。The data unit in the figure is cM.

表2 染色體標記信息Tab.2 The Bin markers locating on chromosome

2.2 發芽期和芽期耐冷表型分析

耐冷親本彩稻和冷敏親本WD在相對發芽率和平均發芽天數這2個發芽期耐冷相關性狀以及成苗率和芽期耐冷級別這2個芽期耐冷相關性狀上存在顯著差異。

RIL群體中各株系表型均呈連續分布，且存在明顯的超親分離現象。其中成苗率的變異系數最大，為33.02%。正態分布的適合性檢驗結果表明，除平均發芽天數的峰度值>1外，其余性狀的偏度和峰度的絕對值均<1，表明RIL群體表型數據基本符合正態分布，屬于典型的數量性狀(表3、圖2)。

表3 RIL群體中發芽期和芽期耐冷表型統計Tab.3 Trait statistic of germination and bud stage in RIL population

圖2 性狀分布Fig.2 Trait distribution

2.3 發芽期和芽期耐冷性QTL定位

共檢測到5個與發芽期耐冷相關的QTL，其中2個與相對發芽率相關，3個與平均發芽天數相關。控制發芽率的2個QTL是qLTG3和qLTG8，其LOD值分別為7.07，2.60，可解釋17.17%，7.89%的表型變異，增效等位基因分別來源于WD和彩稻。與平均發芽天數相關的3個QTL分別是qMLIT3-1、qMLIT3-2和qMLIT5，可解釋7.76%，7.03%，6.62%的表型變異，qMLIT3-1的增效等位基因來源于親本彩稻，qMLIT3-2和qMLIT5的增效等位基因來源于親本WD(表4)。

表4 耐冷相關的QTLTab.4 QTLs related to cold tolerance

共檢測到5個與芽期耐冷相關的QTL，其中2個與芽期耐冷級別相關，3個與成苗率相關。與芽期耐冷級別相關的2個QTL是qCTB1和qCTB3，其LOD值分別為2.92和4.50，表型貢獻率分別為8.45%和10.34%，增效等位基因分別來源于WD和彩稻。與成苗率相關的3個QTL分別是qCTP1-1、qCTP1-2和qCTP3，可解釋的表型變異分別為6.41%，16.17%和10.15%。qCTP1-1與qCTP3的增效等位基因來源于親本彩稻，qCTP1-2的增效等位基因來源于親本WD(表4)。

qLTG3、qMLIT3-1、qCTB3、qCTP3位于同一區間，即這個區間與發芽期和芽期的4個指標均相關。qCTB1、qCTP1-2和qLTG8未有前人報道，可能是新發現的QTL(表4)。

2.4 上位性QTL定位

本研究檢測到2對與芽期耐冷相關的上位性位點，其中芽期耐冷級別檢測到1對上位性位點，存在于3號染色體的C3_5775496～6680588和9號染色體的C9_9364678～9568588之間，LOD值為5.70，貢獻率為13.22%，上位性效應為-0.23。成苗率檢測到1對上位性位點，存在于10號染色體的C10_13739532～16910523和C10_17164368～18300828之間，LOD值為5.55，貢獻率為39.87%，上位性效應為0.19。發芽期未檢測到上位性位點(表5)。

表5 水稻芽期耐冷性的上位性位點Tab.5 Epistasis loci of rice cold tolerance at bud stage

3 結論與討論

低溫冷害貫穿于水稻的各個生育時期。作為冷敏感作物，不同時期的冷害會對水稻造成不同的影響，但最終都會導致產量的降低。近年來，為了提高經濟效益，減少勞動成本，直播稻越發流行。然而，我國東北地區氣候寒冷，直播稻常常遭受發芽期和芽期的低溫，導致種子發芽時間延長，發芽率下降，成苗率和整齊度降低。因此，研究水稻發芽期和芽期耐冷性，對于穩定產量、提高生產力是十分必要的[25]。前人利用不同的作圖群體，對水稻進行了不同時期的低溫試驗，共檢測到250多個與低溫相關的QTL[2]，然而精細定位的QTL僅有13個[26]，包括1個控制發芽期低溫的qLTG-9[27]，1個控制發芽期與苗期低溫的qSV-5c[28]，5個控制苗期低溫的qCTS4[29]、qCTSS11[30]、qSCT1[31]、qSCT11[31]和qLOP2/q[32]，5個控制孕穗期低溫的qLTB3[33]、qCTB7[34]、qCTB8[35]、qCT-3-2[36]和qCTB10-2[37]，1個控制苗期與成熟期低溫的qRC10-2[38]，其中與發芽期相關的僅有2個，與芽期有關的暫時還沒有發現。因此，挖掘發芽期和芽期耐冷QTL，對于耐冷基因挖掘、培育適合直播的水稻品種具有重要意義。

前人大多采用14，15 ℃[39-40]的低溫進行發芽期耐冷試驗。為確定親本間差異最明顯的溫度，本研究共設置了12，13，14 ℃等 3個溫度梯度，研究表明，14 ℃條件下整個群體發芽率普遍極高，差異小；13 ℃條件下兩親本差異最明顯；12 ℃條件下整個群體發芽率都較低，所以本研究最終采用13 ℃作為發芽期鑒定溫度。在芽期耐冷試驗中，前人大多以成苗率為鑒定指標，然而該方法無法對不同恢復程度的秧苗進行劃分，因此本研究還采用了姜樹坤等[23]的方法，將不同單株對耐冷的抗性細分為5個級別，并進行加權計算。結合成苗率和抗性分級的結果，相互驗證定位的QTL。

在發芽期低溫試驗中，共檢測到5個相關的QTL，分別位于第3,5,8號染色體的C3_799335～1393131、C3_9190945～12803492、C5_3760897～5338999和C8_4706534～5480331區間。其中，qLTG3和qMLIT3-1位于同一區間，與王棋等[41]、Fujino等[42]檢測到與低溫發芽率相關的QTL位于相同的區間，且該區間包含已克隆基因qLTG-3-1。該基因編碼一個功能未知的蛋白，在胚中特異性表達從而調節組織的液泡化，進而控制水稻的低溫發芽力。qMLIT3-2位于C3_9190945～12803492區間，與詹慶才等[43]發現的控制低溫條件下苗期株高的QTL位置重疊，說明該QTL可能在發芽期和苗期都有所表達。Jiang等[44]在15 ℃條件下進行發芽期低溫試驗，以發芽率為指標，在9～11 d重復檢測到qLTG5-3，該區間包含本研究測到的qMLIT5。潘招遠[45]以染色體單片段代換系(SSSL)為試驗材料，對15 ℃下控制水稻低溫發芽力的QTL進行鑒定，并在8號染色體上鑒定到2個相關QTL，物理距離分別為36.5～43.0 cM，82.6～91.7 cM，與本研究檢測到的qLTG8在同一條染色體上，但并沒有重合區間，因此，推測qLTG8是一個前人尚未發現的控制水稻低溫發芽力的QTL。

在芽期低溫試驗中，共檢測到5個相關QTL，分別位于第1，3號染色體的C1_14622465～15919601、C1_22079910～22491288和C3_799335～1393131區間。周勇等[46]檢測到一個控制苗期耐冷的QTL，位于RM129～RM11356區間，該區間包含本研究檢測到的qCTP1-1，但由于區間過大，且檢測時期也不同，暫時無法確定這2個QTL之間的關系。任永梅[26]以回交重組自交系為試驗材料，進行發芽期、芽期和苗期的低溫試驗，發現有4個QTL簇在3個時期不同指標間穩定表達，說明少數QTL存在著“一因多效”。本研究芽期檢測到的qCTB3、qCTP3與發芽期檢測到的qLTG3、qMLIT3-1位于同一區間內，說明該QTL在發芽期和芽期均表達，并且在同一時期不同性狀上都有所體現，存在“一因多效”。qCTB1和qCTP1-2位于同一區間，前人尚未在該區間發現芽期耐冷相關QTL，因此，推測該位點可能是一個新發現的QTL。芽期低溫試驗中還檢測到2對上位性位點，但與本研究檢測到的加性位點區間不一致，可能這幾個加性位點間并不存在互作。

綜上所述，本研究利用彩稻與WD雜交衍生的RIL群體為試驗材料，結合978個Bin標記進行發芽期與芽期低溫試驗。共檢測到5個與發芽期耐冷相關的QTL，位于3，5，8號染色體上，可解釋6.62%～17.17%的表型變異，增效等位基因來自2個親本。檢測到與芽期耐冷相關的5個QTL，位于1號和3號染色體上，可解釋6.41%～16.17%的表型變異，增效等位基因來自彩稻和WD。qLTG3在發芽期與芽期試驗中均被檢測到，而且在5個發芽期QTL中表型貢獻率最高。qCTP1-2在5個芽期QTL中表型貢獻率最高。qLTG8、qCTB1和qCTP1-2等3個QTL未見報道。