苦瓜白粉病響應基因McMLO1的克隆及表達分析

陳龍正，劉 靜，劉之洋，夏彭飛，袁希漢，寧 宇

(1.江蘇省農業科學院 蔬菜研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014；2.南京新創蔬菜分子育種研究院有限公司，江蘇 南京 211899)

苦瓜(MomordicacharantiaL.)屬葫蘆科苦瓜屬，原產于亞洲熱帶地區，是一種一年生蔬菜作物。苦瓜風味獨特，同時又兼具降血糖、抗腫瘤及提高免疫力等藥用功效[1-2]，因此，深受人民群眾喜愛。近年來苦瓜產業發展勢頭迅猛，尤其是在我國華南地區種植面積巨大。白粉病是苦瓜生產上面臨的主要病害之一，高溫高濕條件下白粉病在田間的發病率幾乎達到100%[3]，嚴重降低了苦瓜的產量和品質。挖掘抗性基因，培育抗病品種是解決苦瓜白粉病危害最經濟有效的手段。然而，目前尚無苦瓜抗白粉病基因的精細定位和克隆的報道。

MLO(MildewResistanceLocusO)是植物特有的一類基因家族，參與根的形態建成[4]、花粉管發育[5]及干旱脅迫[6]等多種生物學過程。其中，MLO基因最重要的功能之一是負向調控寄主植物對白粉病的抗病反應[7]，在一定程度上相當于植物的“感病”基因。MLO基因發生功能缺失突變后會變成隱性遺傳的mlo基因，而mlo基因可使植物產生對白粉病的抗性[8]。MLO基因首先發現于大麥，其等位功能缺失突變基因Hvmlo賦予了大麥對已知所有白粉病生理小種廣譜且持久的抗性[9]。擬南芥Atmlo2/6/12三基因突變可使擬南芥免疫白粉病的侵染[10]。TALEN技術誘導的MLO基因突變使普通小麥獲得了可遺傳的白粉病抗性[11]。利用RNAi技術沉默MdMLO19基因可有效緩解白粉病對蘋果的危害[12]。上述研究均表明，MLO基因在調控寄主植物的白粉病抗性反應中發揮著重要作用。

目前，基于3代測序技術的高質量的苦瓜參考基因組已公布[13]，這為研究者快速挖掘與白粉病抗性相關的MLO基因奠定了基礎。本研究擬克隆苦瓜MLO基因及其啟動子，分析預測其編碼蛋白的結構與序列特征及系統進化關系，并利用熒光定量PCR技術對其響應白粉病侵染的表達模式進行檢測，旨在為解析MLO基因調控苦瓜白粉病感病反應的分子機理奠定基礎，同時也為進一步利用該基因創制抗白粉病苦瓜種質提供理論參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料K24為江蘇省農業科學院蔬菜研究所特色蔬菜課題組保存的苦瓜高代自交系，表現為對白粉病敏感。

1.2 試驗方法

選取飽滿的種子浸種8 h，在30 ℃的恒溫箱中催芽。選取發芽整齊一致的種子播種于裝有草炭、蛭石(體積比2∶1)的50孔穴盤中，放置于人工氣候箱中培養(晝溫/夜溫為28 ℃/18 ℃，光周期為16 h/8 h)。當幼苗長至四葉一心時，對苦瓜進行白粉病人工接種。接種所用的病原菌采自江蘇省農業科學院蔬菜研究所六合試驗基地，經鑒定和分離后保存的瓜單囊殼白粉菌單孢株系。接種時用毛刷將發病葉片上的新鮮孢子刷入無菌蒸餾水中，使用血球計數板將孢子濃度調至1.0×106個/mL。用噴壺將配制好的孢子液均勻噴到每一片葉片上，直到葉緣有液體滴落。接種后將苦瓜幼苗放置在接種架中，四周用塑料薄膜密封以保持濕度。接種后分別取0，6，12，24，48 h的葉片組織，迅速放入液氮中用于保存備用。

1.3 苦瓜MLO基因的克隆

苦瓜MLO基因CDS的擴增：利用植物總RNA提取試劑盒RNAprep pure Plant Kit(北京天根生化科技有限公司)提取苦瓜葉片RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測RNA的濃度及純度。以高質量苦瓜總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(日本TaKaRa公司)操作說明反轉錄合成第一鏈cDNA?；谝压嫉目喙蠀⒖蓟蚪M，使用Primer 5.0軟件設計用于擴增苦瓜MLO基因的引物(表1)。50 μL PCR體系包括：2 μL cDNA模板，25 μL Phanta Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL及19 μL ddH2O。PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環35次；72 ℃最后延伸10 min。PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段切膠、回收后連接到pEASY-Blunt克隆載體(北京全式金生物技術有限公司)上，熱激法轉化到感受態大腸桿菌DH5α中，挑取PCR檢測為陽性的單克隆，送上海生工公司測序。

表1 本研究使用的引物Tab.1 The sequences of primers used in this study

苦瓜MLO基因全長擴增：采用改良CTAB法提取苦瓜葉片DNA。根據參考基因組序列，截取起始密碼子上游1 500 bp左右的區段作為啟動子，利用引物McMLO1b擴增苦瓜MLO基因全長及其啟動子。PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，循環35次；72 ℃最后延伸10 min?；厥占翱寺y序過程同上。

1.4 序列的生物信息學分析

苦瓜MLO基因結構采用GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)工具進行分析。利用ExPaSy Proteomics Server在線工具(http：//web.expasy.org/protparam/)對苦瓜MLO蛋白的分子量、理論等電點和蛋白質疏水性等理化性質進行預測。通過SOPMA在線工具(http：//pbil.ibcp.fr/)預測MLO蛋白的二級結構，使用TMHMM工具(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0)分析MLO蛋白跨膜結構域，利用CELLO工具(http：//cello.life.nctu.edu.tw/)進行亞細胞定位預測。采用DNAMAN 6.0軟件對不同物種的MLO蛋白進行多重序列比對，采用MEGA 6.0軟件構建MLO蛋白的系統進化樹(Neighbor-joining法，Bootstrap值設置為1 000)。利用PlantCARE 在線工具(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對苦瓜MLO基因啟動子區域的各種響應元件進行分析。

1.5 熒光定量PCR分析

以苦瓜的根、莖、葉、卷須、雄花、子房、果實等組織及白粉病接種后不同時間點的葉片cDNA為模板，分別檢測苦瓜MLO基因的組織表達特異性及其在白粉病脅迫下的表達變化情況。使用Primer 5.0軟件設計定量分析引物qMcMLO1(表1)，苦瓜18sRNA基因(GenBank number：XM_022288719)作為內參基因用于基因表達量的標準化(表1)。20 μL qPCR反應體系包括1 μL cDNA，正、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL，2×abm?EvaGreen qPCR MasterMix(Applied Biological Materials Inc.，Canada) 10 μL及7.4 μL ddH2O。反應在CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad，USA)上進行，擴增程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共40個循環。每個樣本均設置3次重復。采用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量[14]。利用SPSS 20.0軟件對試驗結果進行顯著性方差分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 McMLO1的克隆與生物信息學分析

以苦瓜高代自交系K24的cDNA為模板，以McMLO1a為引物可擴增出1 700 bp左右的目的片段(圖1)。PCR產物測序結果表明，該基因的CDS序列大小為1 707 bp，編碼568個氨基酸，將其命名為McMLO1。以K24的DNA為模板進行擴增測序，發現McMLO1基因的全長序列為4 019 bp，包含15個外顯子和14個內含子。

1，2，3.McMLO1基因克隆；M.2 000 bp Marker。1，2，3.Gene cloning of McMLO1；M.2 000 bp Marker.

ProtParam預測McMLO1蛋白的分子質量為65.40 ku，理論等電點為9.36；不穩定系數為48.34，表明其為不穩定蛋白；親水性平均系數(GRAVY)為-0.062，屬親水性蛋白。McMLO1蛋白具有一個大小為477個氨基酸的MLO保守結構域，符合MLO家族的典型特征。TMHMM分析顯示McMLO1蛋白具有7個跨膜結構域(圖2)，CELLO預測表明，該蛋白定位于細胞膜上；在二級結構上，McMLO1蛋白存在豐富的α-螺旋(42.61%)和無規則卷曲(42.43%)，僅有少量的延伸鏈(10.74%)和β-轉角(4.23%)(圖3)。

圖2 McMLO1蛋白的跨膜結構預測Fig.2 Prediction of McMLO1 transmembrane

藍色.α-螺旋；紅色.延伸鏈；綠色.β-轉角；紫色.無規則卷曲。Blue .Alpha helix；Red.Extended strand；Green.Beta turn；Purple.Random coil.

根據McMLO1基因啟動子序列的擴增測序結果，利用PlantCARE工具對區域內的各種順式作用元件進行分析，結果表明，McMLO1啟動子中含有RNA聚合酶Ⅱ起始轉錄所必需的CAAT-box和TATA-box元件。此外，還具備AE-box、Box 4、GATA-motif等光響應元件，ABRE、TGACG-motif等激素響應元件及WUN-motif等機械損傷響應元件，暗示該基因可能會受到這些信號的調控(圖4)。

圖4 McMLO1基因啟動子區域順式作用元件分析Fig.4 cis-acting elements analysis on promoter region of McMLO1

2.2 McMLO1蛋白序列比對及系統進化分析

利用DNAMAN軟件對McMLO1及其他物種MLO蛋白保守結構域序列進行比對，發現其與黃瓜(Cucumissativus，XP_004142393.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，Q9SXB6.1)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，XP_013451626.1)、豌豆(Pisumsativum，AGJ01118.1)、辣椒(Capsicumannuum，AFH68055.1)、番茄(Solanumlycopersicum，NP_001234814.1)、大麥(Hordeumvulgare，P93766.1)和小麥(Triticumaestivum，AAK94905.1)的序列同源性較高。其中，與黃瓜MLO蛋白同源性最高，達到86.79%。此外，研究還發現，McMLO1蛋白具有7個保守的跨膜結構域(圖5)，這與TMHMM預測分析的結果相一致。

TM.跨膜結構域。TM.Transmembrane domains.

利用MEGA 5.0軟件構建的系統進化樹顯示(圖6)，苦瓜McMLO1與黃瓜、甜瓜、印度南瓜和西葫蘆MLO蛋白聚為一支，這與其同屬于葫蘆科的分類學結論相一致；與之相比，McMLO1與薔薇科的桃、草莓及禾本科的水稻、大麥、小麥MLO蛋白的親緣關系則較遠。

圖6 不同物種MLO蛋白的系統進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of MLO proteins from different species

2.3 McMLO1基因的組織表達特異性分析

利用qRT-PCR方法對McMLO1基因在苦瓜不同組織中的表達量進行了檢測，結果顯示，McMLO1基因的表達具有明顯的組織特異性，在葉中的表達量最高且與其他組織間差異達顯著水平(P<0.05)；其次依次是莖和卷須；在果實中的表達量最低且與其他組織間差異達顯著水平(P<0.05)(圖7)。上述結果表明，McMLO1基因可能主要在葉片中發揮作用。

不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。圖8同。Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05.The same as Fig.8.

2.4 McMLO1基因響應白粉病侵染的表達分析

白粉病接種后，K24葉片中的McMLO1基因的表達量顯著升高，并在6 h達到峰值，較接種前增加了6.2倍，且差異顯著(P<0.05)。表明McMLO1基因可在白粉菌侵染早期被誘導表達。隨后表達量有所降低，但在48 h又有所升高(圖8)。

圖8 McMLO1基因在白粉病脅迫下的相對表達水平Fig.8 Expression analysis of McMLO1 in response to powdery mildew infection

3 結論與討論

白粉病是威脅苦瓜生產栽培最嚴重的病害之一，在高濕環境下的田間發病率幾乎達到了100%。然而，目前高抗白粉病的苦瓜種質資源則十分稀缺[15-16]。因此，鑒定苦瓜白粉病抗性相關基因并利用其對現有品種的抗性進行遺傳改良是解決苦瓜白粉病危害的關鍵環節。MLO基因作為一種感病基因可以負向調控寄主植物對白粉病的抗性，該基因的功能缺失突變可賦予寄主植物廣譜且持久的白粉病抗性[17]。隨著分子生物學的快速發展，借助TALEN、CRISPR等技術手段對MLO基因進行定向編輯可快速創制出高抗白粉病的種質。Wan等[18]利用CRISPR/Cas9技術對VvMLO3基因進行了編輯，顯著提高了葡萄對白粉病的抗性。Nekrasov等[19]同樣利用CRISPR/Cas9技術對SlMLO1進行基因編輯也獲得了白粉病抗性顯著增強的番茄。目前，在辣椒[20]、番茄[21]、甜瓜[22]等多種蔬菜作物上均克隆到了感白粉病的MLO基因。然而，苦瓜中尚未見相關報道。

本研究以苦瓜自交系K24為試驗材料克隆得到了McMLO1基因。序列分析表明，McMLO1基因全長為4 019 bp，其中CDS序列為1 707 bp，包含15個外顯子，編碼568個氨基酸。McMLO1基因編碼的蛋白含有一個由477個氨基酸組成的MLO保守結構域，證實其屬于MLO基因家族。McMLO1蛋白具有7個跨膜結構域，這與已報道的MLO蛋白的典型特征相一致[23]。白粉病侵染后，MLO蛋白主要分布于質膜上并聚集在附著胞周圍[24-25]。本研究中，CELLO亞細胞定位預測表明，McMLO1位于細胞膜上，這與前人的研究結果相吻合。蛋白序列比對發現McMLO1與黃瓜、豌豆等物種上已明確為白粉病感病因子的MLO蛋白的同源性較高，進化關系較為接近，暗示其可能是苦瓜白粉病感病基因，但明確的基因功能仍需進一步的遺傳轉化試驗來驗證。

MLO基因的表達具有組織特異性，且不同物種上的表達模式有所不同。野薔薇RmMLO基因在感病葉片中的表達量最高，在根中則無表達[26]。黃瓜感病基因CsaMLO8在子葉節、葉片和果實中的表達量顯著高于根和下胚軸[27]，而葡萄VvMLO3基因在根中的表達量是花和果實等組織的200倍[28]。在苦瓜中，McMLO1基因在葉片中的表達量顯著高于其他組織，這也暗示該基因主要是在葉片中參與對白粉病的響應調控過程。此外，前人研究表明，白粉病感病基因MLO主要在病原菌侵染前期顯著上調表達，如黃瓜CsaMLO8在白粉病侵染4 h表達量顯著提升[29]，橡膠樹白粉病感病因子HbMLO12在接種后6 h的轉錄本豐度最高[30]。本研究中，苦瓜McMLO1基因在白粉病侵染6 h表達量顯著升高，且高于其他時間點，這與前人研究結果相類似，表明McMLO1是一個白粉病早期響應基因。

綜上所述，本研究克隆了苦瓜McMLO1基因并對其結構特征、進化關系及表達特異性進行了分析，證實其參與了苦瓜對白粉病的響應過程。下一步，通過基因遺傳轉化驗證McMLO1的基因功能，探究McMLO1基因調控寄主感病反應的分子機理將是后續研究工作的重點。