向日葵列當枯斑病病原菌的分離鑒定及致病力分化

張 鍵，王 娜，劉志達，包婷婷，張之為，云曉鵬，石必顯，張 恒，陳貴紅，陳燕芳，趙 君

(1.內蒙古農業大學 園藝與植物保護學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古自治區農牧業科學院植物保護研究所，內蒙古 呼和浩特 010031；3.新疆農業科學院 經濟作物研究所，新疆 烏魯木齊 830091；4.新疆生產建設兵團第十師農業科學研究所，新疆 北屯 836099)

向日葵列當(OrobanchecumanaWallr)又稱高加索列當、毒根草、兔子拐棍，屬列當科(Orobanchaceae)列當屬(Orobanche)的一年生寄生性草本植物[1]，主要為害向日葵、瓜類、茄科和豆類等作物[2]。向日葵列當沒有真正的根，也沒有葉片進行有效的光合作用，它們發育出特殊的入侵器官(吸器)，穿透寄主的根部表皮，直接將其與寄主作物的維管系統連接起來，引導水分、營養物質和其他分子從寄主流向自身，從而破壞寄主的生長發育[3]。向日葵苗期被列當寄生后，不能形成花盤；生長后期被寄生后，植株生長緩慢、莖稈矮化，葉片小而發黃，花盤瘦小，籽粒不飽滿或空秕，產量、品質和含油率大幅降低[4-5]。已有的研究結果表明，向日葵被10株以上的列當寄生時，秕粒增加50%以上[6]，受其危害輕者減產20%左右，重者可達50% 以上[7]。

我國于1959年首次報道了黑龍江省肇州縣向日葵列當的發生[8]。此后，隨著向日葵大面積連作、引種混亂、管理粗放，導致列當在全國各向日葵種植地的發生和危害程度逐年加重[9]。目前，除寧夏向日葵產區外，幾乎我國向日葵的種植區都有列當的發生，但以內蒙古和新疆發生最為嚴重。列當作為向日葵的一種寄生性種子植物也時有病害發生，如李超[10]鑒定出引起瓜列當根腐病的茄病鐮刀菌(F.solani)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)、變紅鐮刀菌(F.lateritium)；丁麗麗等[11]報道了尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、茄病鐮刀菌和禾谷鐮刀菌(F.cerealis)可以引起新疆向日葵列當的莖腐病；徐東升[12]對田間采集的向日葵列當病樣進行分離和鑒定，確定黃瓜枯萎菌(Plectosphaellacucumerina)是引起向日葵列當枯斑病的病原菌。此外，列當還能夠被潛葉蠅(Phytomyzaorobanchia)所寄生，通過在列當莖稈中產卵孵化形成幼蟲，幼蟲的取食造成了列當莖稈的腐爛和折斷[13]。

內蒙古農業大學分子植物病理實驗室在向日葵列當發生危害調查以及取樣過程中，發現在近土表列當的莖稈上有黑褐色條形病斑的形成。列當枯斑病株在向日葵不同種植區都有發生，但發生程度有所不同。發病初期病斑較小，隨著時間的推移病斑逐漸縱向和橫向擴展蔓延。相鄰病斑還能融合形成環繞莖稈的大病斑，從而導致列當莖稈的枯死。因此，本試驗對采自內蒙古、河北和新疆共11個地點29份向日葵列當枯斑病的病樣進行了分離和鑒定，明確了引起向日葵列當枯斑病病原菌的種類，并對分離到的病原菌的致病力分化進行了研究，為向日葵列當生防菌的開發提供一定基礎數據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試的向日葵列當枯斑病樣本采集地點信息見表1，從內蒙古、新疆和河北3個地區共采集樣本29份，其中內蒙古地區樣本共計23份，分別從巴彥淖爾市、呼和浩特市、鄂爾多斯市及烏蘭察布市地塊中采集得到。供試向日葵列當種子采自內蒙古呼和浩特市武川縣大豆鋪村的向日葵地塊，經鑒定生理小種為G小種。

表1 供試樣本信息Tab.1 Test samples information

1.2 供試培養基及試劑

水瓊脂培養基(Water Agar，WA)：瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL定容，121 ℃高溫滅菌30 min；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potato Dextrose Agar，PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1 000 mL，121 ℃高溫滅菌30 min；麥麩培養基：每60 g麥麩加入自來水40 mL，攪拌均勻分裝于300 mL的罐頭瓶中，121 ℃高溫滅菌25 min，滅2次。

供試試劑：CTAB、氯仿、異戊醇、異丙醇，購自北京全式金生物技術有限公司；10×Taq緩沖液、dNTPs、Taq酶和DL2000分子量標準，購自天根生物科技有限公司；卡那霉素購自AMRESCO公司；聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物，由北京厚生博泰科技有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌的分離純化 將發病的向日葵列當莖部洗凈后從病斑的病健交界處切取0.3 cm×0.3 cm大小的薄片，用75%酒精消毒30 s后用無菌濾紙吸干；然后再用0.1%次氯酸鈉浸泡3 min后用無菌水沖洗3次。待發病組織晾干后平鋪在添加有卡那霉素的WA培養基平板上。每個培養皿上放置5片，置于25 ℃恒溫培養。待發病組織四周長出菌絲后，用接種針在周圍的菌落邊緣挑取帶有菌絲的培養基小塊，轉接到PDA培養基上進行培養。待菌落長至培養皿2/3時，采用平板稀釋法進行單孢分離，并獲得純培養。純培養分離物經莖稈接種法進行回接鑒定，7 d后觀察病斑擴展情況，并從病健交界處進行病原物的再分離。

1.3.2 病原菌的形態學鑒定 將單孢后的純培養物接種到PDA培養基上，25 ℃下恒溫培養，待菌絲體長滿皿后，觀察菌落的質地、顏色、基質顏色等。挑取菌落制片后在顯微鏡下觀察菌絲體和孢子的形態。依據形態學觀察結果對分離病原物進行初步的鑒定。

1.3.3 病原菌的分子鑒定 采用CTAB法提取分離物純培養的基因組DNA[14]，利用鐮刀菌EF1-α基因特異性引物EF1/EF2進行PCR[15]，引物為EF1：ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGA；EF2：GGA(G/A)GTACCAGT(GC)ATCATGTT。50 μL PCR反應體系為：引物EF1/EF2各1 μL(10 μmol/L)，10×TaqBuffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，TaqDNA Polymerase 1 μL，DNA模板100 ng，其余用ddH2O補足。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京厚生博泰公司測序。測序結果在NCBI網站上進行Blast比對，根據比對結果確定分離物的分類地位。

根據NCBI網站上Blast比對結果，從GenBank數據庫獲得同源性較高的菌株序列尖孢鐮刀菌(GenBank登錄號：MK059958.1)、茄病鐮刀菌(GenBank登錄號：MN650110.1)、木賊鐮刀菌(GenBank登錄號：KT213293.1)、輪枝鐮刀菌(GenBank登錄號：KF715264.1)、層出鐮刀菌(GenBank登錄號：JX268969.1)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae,GenBank登錄號：GU461623.1)，用DNAMAN進行序列比對分析，構建基于EF-1α基因序列的系統發育樹。

1.3.4 病原菌的回接鑒定與致病力測定 回接鑒定：①將基質、蛭石、沙子按2∶1∶1的比例充分混勻配比成培養土。再按照培養土∶列當種子=500 g∶0.15 g配置接種土。在營養缽中先裝入1/3的培養土，然后裝入1/3的接種土，最后再裝上1/3的培養土，后用水澆透備用。②將向日葵種子(LD5009)開口向下豎直插入到浸濕的土壤中，再在上面覆蓋一層營養基質，以剛好蓋住向日葵種子為宜。將上述營養缽置于溫室中按時間進行澆水，70 d后開始在列當莖稈上進行人工接種。③在列當莖稈上(地上部5～10 cm)用滅菌牙簽刺出傷口。打取PDA平板上培養7 d的菌餅(5 mm)，將帶有菌絲的培養基面朝向莖稈一面緊貼在傷口位置，并用保鮮膜將接種的PDA菌塊緊緊裹在莖稈上。用沒有接菌的PDA培養基作為對照。每個菌種分別接5株列當，7 d后觀察病斑的擴展情況。

病原菌分生孢子液的制備：將29株列當枯斑病病原菌經PDA培養基活化培養5～7 d后，用內徑8 mm的滅菌打孔器在菌株邊緣打出菌餅，接入麥麩培養基，25 ℃培養5～7 d。用無菌水沖洗麥麩培養基，4層滅菌紗布過濾后獲得分生孢子液。用血球計數板計數，將分生孢子液的濃度調至1.0×107個分生孢子/mL后備用。

病原菌在列當上的致病力測定：列當的種植參照1.3.4回接鑒定的方法。列當生長70 d后，在列當莖稈上(地上部5～10 cm)用滅菌牙簽在葉柄基部刺出傷口，將準備好的分生孢子液20 μL滴在葉柄基部，取適量脫脂棉，用保鮮膜裹在莖稈接種部位上，以無菌水作為對照。接種后的植株置于22～23 ℃溫室條件下進行繼續培養。每個菌株分別接3株列當，7 d后觀察病斑的擴展情況。

病原菌在向日葵上的致病力測定：向日葵種子(LD5009)播種到裝有滅菌土的營養缽中，待長至2～4片真葉時，用滅菌牙簽在中部葉柄基部刺出傷口，將準備好的分生孢子液20 μL滴在葉柄基部，取適量脫脂棉，用保鮮膜裹在莖稈接種部位上，以無菌水作為對照。接種后的植株置于22～23 ℃溫室條件下進行繼續培養。每個菌株分別接3株向日葵，14 d后觀察病斑的擴展情況。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離和回接鑒定

內蒙古、河北和新疆11個不同地區采集的列當枯斑病樣本中共分離獲29株純培養的分離物。依據分離物在PDA培養基的菌落形態以及分生孢子形態可分為5種類型(圖1)。

A.菌落正面；B.菌落背面；C.分生孢子形態；D.再分離菌株的菌落形態。A.Front of the colony；B.Back of the colony；C.Conidia morphology；D.Colony morphology of the re-isolated strain.

第1類以GHC1-2為代表的分離物氣生菌絲呈白色致密絲絨狀，生長3 d后，基物表面由白色轉紫色，有許多小型分生孢子，卵圓形，大型分生孢子為鐮刀形，大小為15.72～39.89 μm×5.12～13.46 μm，共有16個分離物；第2類以XHZ1-7為代表的分離物氣生菌絲白色薄絨狀，邊緣整齊，基物表面白色，背面白色至淡黃色，孢子量多，分生孢子較大呈鐮刀形，大小為35.53～44.75 μm×6.30～15.65 μm，兩端較鈍，極少見小型分生孢子，共有8個分離物；第3類以XGD3-13為代表的分離物氣生菌絲白色棉絮狀，邊緣不規則，基物表面和背面都為白色，大型分生孢子鐮刀形，孢子大小為37.16～53.50 μm×8.83～16.33 μm，數量多，兩端較尖，厚垣孢子圓形，串生，共有3個分離物；第4類以KBX-2為代表的分離物氣生菌絲白色棉絮狀，基物表面中央呈淡黃色，分生孢子長橢圓形，大小為16.10～22.50 μm×10.04～17.59 μm；第5類以XGD-1為代表的分離物氣生菌絲絨狀，基物表面白色，背面淡黃色。小型分生孢子數量多，橢圓形或卵圓形，大型分生孢子鐮刀形，大小為16.77～20.15 μm×5.62～9.51 μm。

將29株分離物經莖稈接種法回接至列當，7 d后觀察發現，29株分離物均能侵染列當，并形成與田間癥狀一致的黑褐色條形病斑(圖2)。對回接后的發病列當進行病原物的再分離，均能分離到與接種物形態一致的分離物(圖1-D)。因此，確定分離到的29株分離物為引起向日葵列當枯斑病的病原菌。

A.田間發病病斑；B.分離物回接后發病情況。A.Disease spots in the field；B.The incidence of the disease after the separations were reconnected.

2.2 病原菌的分子鑒定

以29株分離物DNA為模板，用EF-1α引物進行PCR擴增，擴增片段經測序后在NCBI網站上進行Blast比對，結果表明，29株分離物分別屬于5個種(圖3、表2)。新疆北屯農十師183團、內蒙古呼和浩特市武川縣西海子村和烏蘭察布市四子王旗公合成村的樣本中都獲得2種病原物，鑒定為尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌；內蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗西小召鎮、烏蘭察布市化德縣105省道邊和鄂爾多斯市東勝區都獲得1種病原物，為尖孢鐮刀菌；內蒙古烏蘭察布市四子王旗西圪旦村樣本中分別獲得3種病原物，分別為木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和層出鐮刀菌；內蒙古巴彥淖爾市五原縣葵博園樣本中分離得到2種病原物，分別為木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌；而新疆北屯農十師188團、內蒙古巴彥淖爾市臨河區永利村和河北省張家口市康保縣樣本中都分別獲得1種病原物，分別為茄病鐮刀菌、木賊鐮刀菌和輪枝鐮刀菌(表2)。

A.EF1-α引物PCR 擴增電泳：M.DL2000 Marker;1—8.隨機8株菌株;+.陽性對照；-.陰性對照。B.菌株GHC 1-2序列比對結果。A.The electrophoresis diagram of PCR amplification by EF1-α primer：M.DL2000 Marker；1—8.Random 8 strains；+.Positive control；-.Negative control.B.Strain GHC 1-2 sequence alignment results.

表2 列當枯斑病病原菌分子鑒定Tab.2 Molecular identification results of pathogens of broomrape necrotic spot

2.3 病原菌的遺傳聚類分析

為了確定分離獲得的鐮刀屬病原物的遺傳距離，將上述病原物與從GenBank中來源于不同寄主的鐮刀菌以及大麗輪枝菌進行遺傳聚類分析，結果表明，所有鐮刀屬病原物被劃分為5個類群，分別是尖孢鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、層出鐮刀菌、木賊鐮刀菌、茄病鐮刀菌。其中，茄病鐮刀菌與尖孢鐮刀菌的遺傳距離最遠，與木賊鐮刀菌遺傳距離最近；而木賊鐮刀菌單獨聚為一支，和層出鐮刀菌的遺傳距離相對較近；而尖孢鐮刀菌、輪枝鐮刀菌與層出鐮刀菌的遺傳距離最近，單獨聚為一個遺傳分支(圖4)。

圖4 鐮刀菌屬不同種的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of different species of Fusarium

2.4 病菌的致病力分化

采用分生孢子液定量接種法，將枯斑病病原菌分別接種于列當和向日葵莖稈上，病斑大小統計結果見表3。結果表明，鐮刀菌屬種內不同菌株間的致病力存在顯著差異，對列當而言，16株尖孢鐮刀菌中致病力最強的是菌株GHC 1-2和XXZ-9，病斑長度達4.60 cm和4.57 cm，而致病力最弱的菌株WYKBY-5病斑長度僅為0.80 cm，相差近4.00 cm；3株木賊鐮刀菌中，YL-1和WYKBY-2分別為致病力最強和最弱菌株，病斑長度分別為2.93，0.83 cm；茄病鐮刀菌的種內差異相對較小，8株菌中致病力最強的XHZ 1-7和致病力最弱的XHZ 1-2病斑長度僅相差1.47 cm；對向日葵而言，16株尖孢鐮刀菌中致病力最強的是菌株XXZ-13，致病力最弱的是菌株HD 1-1，病斑長度僅為0.23 cm；茄病鐮刀菌8株菌中致病力最強的是菌株183 2-4，病斑長度為1.23 cm，其余菌株病斑長度為0.37～0.73 cm；3株木賊鐮刀菌中，WYKBY-2菌株致病力最強，病斑長度為0.83 cm，YL-1菌株致病力最弱，病斑長度為0.37 cm(表3)。總體來看，茄病鐮刀菌和木賊鐮刀菌的種內差異小于尖孢鐮刀菌。

表3 枯斑病菌對向日葵列當和向日葵的致病力Tab.3 The pathogenicity of pathogens on broomrape and sunflower cm

相較于列當，29株枯斑病菌對向日葵的致病力整體偏弱，病斑長度介于0.23～2.33 cm，其中病斑長度小于0.50 cm的菌株有11株；而在列當莖稈上，病斑從接種部位縱向擴展，隨著時間的推移形成環繞莖稈的大的黑褐色病斑，整體致病力表現較強，病斑長度介于0.80～4.60 cm，病斑長度超過3.50 cm的菌株有6株。其中尖孢鐮刀菌的菌株GHC 1-2和HD 1-1在向日葵上病斑長度較小，僅為0.40，0.23 cm，在列當上的病斑長度較大，為4.60，4.17 cm；其次為菌株XXZ-9在向日葵上形成的病斑長度較小，僅為 0.83 cm，而在列當上形成的病斑長度較大，為4.57 cm，其在列當上的致病力僅次于菌株GHC 1-2。通過在列當和向日葵上病斑大小的比較，共篩選得到3株在向日葵上致病力弱但列當上致病力強的枯斑病菌，它們分別是尖孢鐮刀菌的GHC 1-2、XXZ-9和HD 1-1(圖5)。

A.病原菌在列當上的致病情況；B.病原菌在向日葵上的致病情況。A.The pathogenic of pathogens on sunflower broomrape；B.The pathogenic of pathogens on sunflower.

3 結論與討論

本研究利用柯赫氏法從內蒙古、河北和新疆共11個不同地點29份樣本中鑒定出的5種鐮刀菌屬不同的種，即尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、木賊鐮刀菌、輪枝鐮刀菌和層出鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌是引起向日葵列當枯斑病菌的優勢種。這一結果和國內的研究者從田間采集發病列當植株分離獲得的多種鐮刀菌菌株的結果相一致，如李超[10]鑒定出茄病鐮刀菌、木賊鐮刀菌、變紅鐮刀菌是引起瓜列當根腐病的主要致病菌，并從中篩選出7株強致病力菌株作為生防菌進行安全性評價；丁麗麗等[11]證明了從向日葵列當上分離得到尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和禾谷鐮刀菌是引起新疆向日葵列當莖腐病的主要致病菌；何偉等[16]對新疆加工番茄分枝列當的病樣進行了分離鑒定，發現尖孢鐮刀菌對分枝列當有較強致病力。而上述報道中從列當病樣中分離獲得的變紅鐮刀菌和禾谷鐮刀菌在本研究的樣本中沒有分離得到，本研究中所分離到的層出鐮刀菌和輪枝鐮刀菌也未見有過相關的報道。

為了進一步研究29株菌株分別在向日葵和列當上的致病性，本研究采用分生孢子液定量接種葉柄和莖稈交界處的方法進行向日葵和列當的致病性評價，將鐮刀菌菌株分別接種于向日葵和列當后，鐮刀菌均同時能夠侵染向日葵和列當，但致病力存在明顯的差異，都表現出在其分離寄主上致病力強于其他寄主作物的特性。對供試菌株在向日葵和列當上的致病力分化進行研究，結果表明，從29株枯斑病菌中篩選出3株在向日葵上致病力較弱，但在列當上致病力較強的菌株，分別為尖孢鐮刀菌的GHC 1-2、XXZ-9和HD 1-1，這些菌株具有開發為防控列當，生防菌株的潛力。國內外很多研究者也發現，鐮刀菌可以作為雜草的重要病原菌對雜草進行防控，王亞嬌等[17]從感病彎管列當上分離得到20株鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌 Br-2能夠有效抑制彎管列當種子萌芽，抑制率可達 71.79%；孔令曉等[18]分離的致病鐮刀菌L2菌株，能通過損傷芽管抑制列當種子萌發；Thomas等[19]研究發現，尖孢鐮刀菌能夠在向日葵列當地下生長階段進行侵染，顯著降低列當種子的萌芽和寄生率；吳元華等[20]利用硫磺調節土壤酸堿度的基礎上，施用生防鐮刀菌可推遲向日葵列當出土3 d，對煙田向日葵列當防效達62.44%；而Chen等[21]篩選的鏈霉菌(Streptomycesenissocaesilis)能夠抑制向日葵列當種子萌芽，對列當的防治效果可達 47%；Thomas等[22]報道利用尖孢鐮刀菌FoxyⅠ和Foxy Ⅱ的孢子懸浮液作為生防菌對向日葵列當、鋸齒列當和分枝列當進行防控；Müller-St?ver 等[23]制備的海藻酸鈉鐮刀生防菌顆粒則是通過侵染列當植株莖部發病而達到防治列當的目的。本研究篩選到的3株鐮刀菌對營養要求不嚴，容易培養，還可在促孢培養基上形成大量的孢子，所以認為這些菌株可以作為有潛力的生防菌用于防控列當對向日葵的寄生。但由于許多鐮刀菌也是農作物的重要病原菌，因此還需進一步考慮篩選用作生防的菌株對作物的安全性。