綠盲蝽取食誘導赤霞珠冬芽全蛋白雙向電泳體系的建立與優化

高素紅，葛長虹，周國娜，姚淑娟，路常寬，高寶嘉

(1.河北農業大學 林學院，河北 保定 071001；2.河北科技師范學院 農學與生物科技學院，河北 昌黎 066600；3.河北省作物逆境生物學重點實驗室，河北 昌黎 066600)

近年來，綠盲蝽(ApolyguslucorumMeyer-Dür)發生愈加猖獗，對釀酒葡萄產業產生嚴重威脅。前期的研究表明，早春綠盲蝽對葡萄冬芽的危害是影響酒葡萄植株長勢和全年產量、質量的關鍵因素[1]。已有的研究證實，植食性昆蟲通過唾液蛋白消化溶解植物的營養物質進行取食，而植物則利用自身某些結構蛋白和昆蟲唾液蛋白中的激發子進行特異結合，產生誘導抗性反應，生成抗性蛋白和抗性物質，實現對昆蟲的抵抗[2]。目前，綠盲蝽唾液蛋白與赤霞珠葡萄結合的受體蛋白仍不清楚。因此，通過獲得綠盲蝽取食誘導下赤霞珠葡萄冬芽的全蛋白，進而鑒定出與綠盲蝽唾液蛋白特異性結合的蛋白受體，對于揭示赤霞珠葡萄對綠盲蝽取食產生防御反應的分子機制具有重要意義。

蛋白質組學是研究特定時間、空間以及環境因子等條件下，生物物種個體、器官、組織、細胞以及體液等的總蛋白質表達圖譜的常用手段[3]，也是當下研究的熱點領域之一。1975年，蛋白質組學首先由O′Farrell[4]建立。Bjellqvist等[5]在1982年利用改進的雙向電泳技術得出凝膠圖譜，看到明顯的蛋白點，再結合質譜分析技術對蛋白點進行測定。已經建立的蛋白數據庫包括UniProt(SWISS-PROT、TrEMBL和PIR-PSD)、PDB、BioGRID、DDBJ、ExPasy、Gepasi、IntAct、KEGG、MINT、MS-Fit、NCBI、STRING等[6-7]，可快速鑒定已知蛋白質種類。雙向電泳技術仍是目前獲得動植物全蛋白質組，尋找差異蛋白，蛋白質定性定量，篩選、鑒定蛋白受體以及揭示其蛋白水平變化機制的經典研究手段[8-11]。目前，有關赤霞珠葡萄冬芽的蛋白質組學相關研究尚未見報道。

本研究以綠盲蝽取食誘導下赤霞珠葡萄冬芽為試材，通過比較分析不同的蛋白提取方法、上樣量及考馬斯亮藍染色所得到的赤霞珠葡萄冬芽全蛋白雙向凝膠電泳圖譜效果，構建適用于葡萄冬芽蛋白質分析的最佳雙向電泳技術體系，以便為后續揭示在綠盲蝽取食誘導和機械損傷下，赤霞珠葡萄蛋白質組的差異變化，篩選差異蛋白，分析其功能和結構以及為綠盲蝽取食誘導赤霞珠葡萄抗性反應和抗性機制的進一步研究提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試昆蟲 綠盲蝽由河北省植物保護研究所(保定)提供，在27 ℃、L∶D = 16 h∶8 h、強度66%、濕度60%條件下，用新鮮四季豆飼養綠盲蝽試驗種群。挑選大小一致的3齡若蟲[12-13]，試驗前4～6 h饑餓處理，進行接蟲試驗。

1.1.2 樣品采集 在河北省昌黎縣朗格斯酒莊有限公司釀酒葡萄種植基地進行試驗。供試釀酒葡萄品種為赤霞珠，生長狀況良好。選擇同一葡萄植株上距地面50～100 cm外觀和長勢一致的2個飽滿冬芽作為樣本，分別編號記作接蟲芽和對照芽。其中，接蟲芽：于冬芽上接入5頭健壯的綠盲蝽3齡若蟲后套袋；對照芽不進行任何處理直接套袋。每處理3次重復。24 h后分別摘取葡萄冬芽樣品置于液氮暫存，然后轉移至實驗室放置于-80 ℃冰箱凍存。

1.1.3 試劑與儀器

1.1.3.1 生化藥劑 TCA、Acetone、2-Hydroxy-1-ethanethiol、PVPP、Sucrose、SDS、Tris-base、HCl、Ammonium acetate、Methyl alcohol、Urea、Thiourea、CHAPS、DTT、Ampholyte solution、Ampholime、Bromophenol blue、Coomassie brilliant blue、GLYCEROL、Iodoacetamide、Acrylamide、Ammonium persulphate、TEMED、Glycine、Low melting point agarose、平衡酚、雙甲叉丙烯酰胺，以上藥品購自Sigma公司，均為分析純。mineral oil、IPG干膠條pH值 3～10 24 cm、pH值4～7 17 cm購自 GE Healthcare公司。標準分子量蛋白Marker購自Thermo公司。

蛋白提取液、蛋白裂解液、平衡液A、平衡液B、SDS-PAGE凝膠溶液、0.5%低熔點瓊脂糖溶液、固定液、染色液、脫色液的配制方法參考王銀翠等[14]的方法進行。

1.1.3.2 主要儀器 GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)、掃描儀(ImageScannerⅢ)、723可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)、冷凍干燥機(LABCONCO)、FA2204B電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)、雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(GE)、電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫療儀器廠)、XH-C渦旋混合器(榮華儀器制造有限公司)、搖床、移液器(Eppendorf)、石英比色皿等。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋白質樣品制備與濃度測定 TCA-丙酮法參考王銀翠等[14]的方法。取凍存的赤霞珠冬芽0.3～0.4 g，充分研磨，分步加入蛋白提取液Ⅰ、Ⅱ萃取蛋白，純白色沉淀冷凍干燥后得到蛋白粗提干粉。稱質量，計算粗蛋白質產率。

酚抽提方法參考王瑞璞等[15]的方法，有改動。取0.1～0.2 g粗蛋白干粉，加入2 mL Tris平衡酚和2 mL SDS Buffer于10 mL小管中；充分渦旋30 s，離心3 min；將上層的酚相吸出，放入一新管中，剩余液體繼續提取酚相；將冷醋酸銨甲醇溶液加入最終所得的酚相中，放入-20 ℃冰箱靜置沉降30 min取出，離心5 min；將沉淀再用冷醋酸銨甲醇溶液洗2次，再用預冷的80% 丙酮洗2次后冷凍干燥。蛋白干粉-80 ℃凍存備用。

利用CBB G-250染色法測定蛋白質濃度。

1.2.2 雙向凝膠電泳 選用24 cm pH值3～10和17 cm pH值 4～7 這2種規格IPG預制膠條(-20 ℃凍存)，設置400，800 μg蛋白上樣量，加入裂解液充分裂解。將不同處理蛋白液加入GE聚膠槽，預制IPG膠條膠面朝下吸收12 h樣品溶液。往膠槽緩慢加入2～3 mL礦物油，相鄰2個膠條槽也要放滿礦物油，夾好電極，設置第一向等電聚焦程序：250 V快速升壓除鹽1 h，500 V線性升壓除鹽2 h，1 000 V線性升壓除鹽1 h ，4 000 V線性升壓1 h，8 000 V線性升壓1 h ，8 000 V 聚焦48 000 V·h ，1 000 V保持任意時間。聚焦結束后，立即平衡膠條，并制備12% 蛋白分離膠，進行第二向 SDS-PAGE 電泳。電泳結束后，取出凝膠，劃邊并切角作記號(酸性端)。

1.2.3 凝膠染色 熱考馬斯亮藍R-350染色法：電泳結束后，將蛋白分離膠放入固定液中，于搖床上緩慢搖動30 min進行固定。用電磁爐將配制好的R-350凝膠染色液加熱至90～100 ℃[16]，將凝膠放入其中，并置于搖床上緩慢搖動15 min進行染色，至背景與染液一致。染色結束后，將凝膠放入配制好的脫色液中，搖床上緩慢搖動30 min。脫色液與背景相近，則需更換新鮮的脫色液，重復3～4次，直到凝膠背景清晰，能看到蛋白點為宜。

冷考馬斯亮藍R-350、R-250染色法：方法同上，省略掉第2步加熱環節，將凝膠直接放入染色液中搖床輕微搖動60 min以上。脫色時過夜進行。

1.3 凝膠圖像掃描和分析

利用ImageScanner Ⅲ 掃描儀掃描SDS-PAGE凝膠圖譜，獲得電子圖像；利用PDQuest Advanced-8.0.1凝膠分析軟件進行蛋白點豐度檢測等圖像分析。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白提取方法比較

采用TCA-丙酮法和TCA-丙酮法+酚抽提的方法提取赤霞珠葡萄冬芽粗蛋白干粉，結果表明(表1)，TCA-丙酮法提取赤霞珠冬芽粗蛋白干粉質量在0.028 7～0.039 6 g，產率為1%左右，蛋白濃度約為89.450 0 μg/mL；TCA-丙酮法+酚抽提法提取粗蛋白干粉質量在0.002 9～0.004 3 g，產率僅占樣本的0.1%左右，蛋白濃度約為187.400 0 μg/mL，表明TCA-丙酮法+酚抽提法所提出的蛋白干粉更純，但產率較低。

表1 不同提取方法赤霞珠冬芽全蛋白質量及濃度比較Tab.1 Comparison of total protein quality and concentration of winter buds of Cabernet sauvignon with different extraction methods

利用2種提取方法所得全蛋白粉進行雙向凝膠電泳試驗，采用pH 值3～10 NL 24 cm IPG膠條，結果如圖1秘示，綠盲蝽取食誘導赤霞珠葡萄冬芽內大多數蛋白點分布在pH 值 4～7內，分子質量為20～100 ku。通過PDQuest凝膠圖譜分析，TCA-丙酮法提取赤霞珠冬芽全蛋白凝膠圖譜上檢測到699個蛋白點(圖1-A)，且點的顏色較深，更圓更清晰；而TCA-丙酮法+酚抽提赤霞珠冬芽全蛋白凝膠圖譜上僅檢測到246個蛋白質點，并且蛋白點較TCA-丙酮法顏色淺，數量少(圖1-B)。相較而言，TCA-丙酮提取方法效果更好，蛋白丟失少。

A.TCA-丙酮法全蛋白2-DE圖像；B.TCA-丙酮法+酚抽提全蛋白2-DE圖像。 A.TCA-acetone total protein 2-DE image；B.TCA-acetone+phenol extraction total protein 2-DE image.

2.2 不同蛋白上樣量比較

分別選用400，800 μg粗蛋白上樣量，采用pH值4～7 NL 17CM IPG膠條，水化上樣，進行第一向等電聚焦電泳及第二向SDS-PAGE凝膠電泳，利用凝膠掃描儀得到蛋白圖譜，如圖2所示，圖2-A、C為上樣量400 μg凝膠蛋白圖譜，不同分子量蛋白可分辨率高，蛋白點數多，能進行有效的分離。蛋白點圓，邊界清晰；對于上樣量為800 μg凝膠圖譜(圖2-B、D)，蛋白點可分辨率較低，橫縱向拖尾現象嚴重，不能進行有效分離，蛋白點邊界模糊。

A.綠盲蝽取食誘導赤霞珠冬芽400 μg蛋白上樣量的2-DE圖像；B.綠盲蝽取食誘導赤霞珠冬芽800 μg蛋白上樣量的2-DE圖像；C.對照400 μg蛋白上樣量的2-DE圖像；D.對照800 μg蛋白上樣量的2-DE圖像。A.2-DE image of 400 μg protein loading amount of Cabernet sauvignon winter bud induced by Apolygus lucorum feeding；B.2-DE image of 800 μgprotein loading amount of Cabernet sauvignon winter bud induced by Apolygus lucorum feeding；C.2-DE image of 400 μg protein loading amount；D.2-DE image of 800 μg protein loading amount.

從圖2可以看出，綠盲蝽取食刺激赤霞珠葡萄冬芽的全蛋白凝膠圖譜(圖2-A)和健康葡萄冬芽的蛋白凝膠圖譜(圖2-C)相較，蛋白點數量、大小、深淺均有很大差異，甚至出現某些蛋白點消失或者增加的現象。利用PDQuest蛋白分析軟件對比分析，健康的赤霞珠葡萄冬芽(對照)全蛋白凝膠圖譜上檢測到543個蛋白點，而綠盲蝽取食刺激后赤霞珠葡萄冬芽全蛋白凝膠圖譜上檢測到699個蛋白點。綠盲蝽取食刺激脅迫后，赤霞珠葡萄冬芽蛋白點明顯增多，部分蛋白含量也發生明顯變化，出現差異蛋白。表明綠盲蝽取食刺激可誘導赤霞珠葡萄冬芽蛋白質組發生改變，產生防御反應，其形成的防御蛋白可進一步利用質譜進行差異蛋白定性定量分析。

2.3 不同考馬斯亮藍染劑比較

2.3.1 R-250、R-350與G-250染色效果比較 雙向電泳技術中有關蛋白的染色方法，以考馬斯亮藍染色法最為常用。本研究采用R-250、R-350與G-250 3種染劑對聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白點進行染色，對比分析圖譜效果。R-350染色后圖像背景清晰，對比度高，蛋白點分辨率高(圖3-A)；R-250染色效果和R-350無明顯差異(圖3-B)，R-350和R-250均適用于雙向凝膠電泳圖譜染色。從圖3-C可以看出，G-250染色法圖像背景模糊，蛋白點分辨率低，不適用于雙向凝膠電泳圖譜染色。試驗結果表明，R-250、R-350與G-250相比，能得到更高分辨率的凝膠圖像，容易進行圖譜分析。

A.綠盲蝽取食誘導赤霞珠冬芽全蛋白R-350染劑2-DE圖像；B.綠盲蝽取食誘導赤霞珠冬芽全蛋白R-250染劑的2-DE圖像；C.綠盲蝽取食誘導赤霞珠冬芽全蛋白G-250染劑的2-DE圖像。A.2-DE image of the total protein R-350 dye of Cabernet sauvignon winter buds induced by Apolygus lucorum feeding；B.2-DE image of the total protein R-250 dye of Cabernet sauvignon winter buds induced by Apolygus lucorum feeding；C.2-DE image of the total protein G-250 dye of Cabernet sauvignon winter buds induced by Apolygus lucorum feeding.

2.3.2 熱染法和冷染法染色效果比較 由圖4可知，經過R-350冷染色和加熱染色后的凝膠圖譜背景均較為清晰，蛋白點對比度高，低濃度蛋白也得到較好的顯現。從染色時間上比較，采用熱染法比冷染法在染色和脫色時間上明顯減少。熱染法染色時間僅需15～20 min，而冷染法則至少需要60～120 min。熱染法不僅縮短了染色時間，而且凝膠背景清晰，易脫色，脫色時間不超過60 min；冷染法需要時間更長，需要過夜脫色。試驗結果表明，綠盲蝽取食誘導赤霞珠葡萄冬芽蛋白質組雙向凝膠電泳體系采用熱染法更加省時高效，且操作簡單、效果良好。

A.綠盲蝽取食誘導赤霞珠冬芽全蛋白R-350熱染色的2-DE圖像；B.綠盲蝽取食誘導赤霞珠冬芽全蛋白R-350冷染色的2-DE圖像。A.2-DE image of R-350 hot staining of Cabernet sauvignon winter buds total protein induced by Apolygus lucorum feeding；B.2-DE image of R-350 cold staining of Cabernet sauvignon winter buds total protein induced by Apolygus lucorum feeding.

3 討論與結論

3.1 蛋白提取方法對雙向電泳圖譜的影響

植物全蛋白的提取方法種類較多，不同材料采用的提取方法也有一定的差異。已有研究結果顯示，幼嫩組織蛋白提取常采用TCA-丙酮法，酚提取法適用于復雜樣本的蛋白提取[17-18]。目前報道的有關葡萄不同器官中全蛋白的提取方法都各有差異[15，19-20]。本試驗提取釀酒葡萄赤霞珠冬芽全蛋白時，采用了常用提取方法TCA-丙酮法和王瑞璞等[15]提取葡萄種子蛋白的TCA-丙酮法+酚抽提法2種方法，證實TCA-丙酮法提取蛋白方法簡單，蛋白不易丟失，蛋白量大，進一步進行雙向電泳凝膠圖譜效果也較好；而TCA-丙酮法+酚抽提法工藝復雜，雖然雜質去除效果較好，提取蛋白更純，但缺點是蛋白提取量少，蛋白易丟失。這與王瑞璞等[15]對葡萄種子蛋白質雙向電泳技術的研究結果存在明顯差別，表明相同植物不同部位的蛋白質含量及提取方法都有所差別。

3.2 蛋白上樣量對雙向電泳圖譜的影響

蛋白上樣量的大小決定雙向電泳凝膠圖譜的分辨率。索慧英等[21]研究了楊樹葉片蛋白質雙向電泳上樣量對凝膠圖譜的影響，認為上樣量過小，樣本蛋白點表現的不完全；上樣量過大，蛋白點過多，不易分離，多為無效蛋白點。本研究摸索了適用于赤霞珠葡萄冬芽雙向電泳體系的樣本量，對于pH值3～10 NL 24 cm和pH值4～7 NL 17 cm 的IPG膠條，上樣量為400 μg蛋白干粉時，所得凝膠圖譜蛋白點清晰，易于分離；800 μg蛋白上樣量，蛋白點不易分離，會產生嚴重的橫、豎向拖尾現象。

3.3 考馬斯亮藍染劑對雙向電泳結果的影響

考染以其操作簡便、靈敏度僅次于銀染，且可用于切下蛋白質進行質譜分析等特性，在雙向凝膠電泳技術中占有重要地位。染色效果好的凝膠圖譜，背景清晰，蛋白點光滑，對比度高[22]。本試驗R-250和R-350 染劑均適合于釀酒葡萄赤霞珠冬芽全蛋白雙向電泳凝膠染色，其中R-350染色是所有染料中唯一可以達到幾乎無背景的染色方法，且經過改進其染色和脫色時間大為節省。G-250染劑則應用于蛋白濃度或含量測定，不適用于SDS-PAGE凝膠圖譜染色。此外，熱染法較冷染法在染色和脫色更為節省時間，操作簡單，且圖像背景清晰度和蛋白點對比度無顯著差異。因此，在后續試驗中建議使用R-350 熱染色法。

3.4 結論

本研究建立并優化了綠盲蝽取食脅迫下赤霞珠冬芽防御反應的蛋白質組學雙向電泳技術體系，結果表明，利用TCA-丙酮法抽提蛋白，400 μg蛋白上樣，pH值 4～7 NL 17 cm 的IPG膠條、8 000 V 聚焦48 000 V·h 、G-350熱染色雙向電泳技術體系得到的赤霞珠冬芽全蛋白凝膠圖譜，符合綠盲蝽取食誘導赤霞珠防御反應產生防御蛋白的檢測要求。綠盲蝽取食刺激脅迫后，赤霞珠葡萄冬芽蛋白點明顯增多，部分蛋白含量也發生明顯變化，出現差異蛋白。表明綠盲蝽取食刺激可誘導赤霞珠葡萄冬芽蛋白質組發生改變，產生防御反應。

環境脅迫條件下植物的不同組織、器官和亞細胞水平的蛋白表達水平變化的研究報道很多[23-26]。植物突變體差異表達蛋白挖掘、分離、鑒定有助于了解基因和蛋白質的功能，在遺傳、毒理、抗逆性、抗藥性分子機理等方面具有重要的理論意義和實用價值[27-30]。進一步深入研究綠盲蝽取食脅迫下赤霞珠葡萄防御反應和保護機制的分子基礎，明確其蛋白質組水平上的變化，差異表達蛋白質的歸屬、性質和功能，篩選與抗性相關的特異蛋白。并與抗性基因聯合分析，推測和驗證特異蛋白與抗性相關基因之間的關鍵通路，可為揭示綠盲蝽取食誘導赤霞珠抗性反應機制，合理有效地開展抗性育種或新型殺蟲劑的研發提供研究基礎。