羊口瘡病毒ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞周期、凋亡及免疫細胞因子的影響

王憲軍，向 華，張旭梅，任玉鵬，朱江江

(1.西南民族大學 畜牧獸醫學院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用 四川省重點實驗室，四川 成都 610041)

羊口瘡是由口瘡病毒(Orfvirus，ORFV)引起的以病羊口唇、鼻等部位形成水泡、膿皰或痂皮等特征的人獸共患傳染病，主要侵害山羊、綿羊等小反芻獸[1-2]。羊口瘡的流行不僅影響畜牧業的發展，也嚴重威脅著人類的健康[3]。當前主要通過接種疫苗的方式來控制ORFV的感染。然而，目前尚無商品化的疫苗來預防該疾病的發生。羊口瘡反復暴發的現狀已成為制約養羊產業發展的瓶頸和重要的公共衛生問題。假如能夠通過對ORFV誘導機體免疫反應的分子機制研究從而推動羊口瘡靶向藥物的研發，將從根本上解決目前羊口瘡治標不治本的現狀。因此，ORFV誘導機體免疫反應的分子機制研究成為急需解決的關鍵科學問題，對于推動養羊產業的健康發展和保障人類人身安全具有重要的理論價值和現實意義。

ORFV屬于痘病毒科副痘病毒屬，是一種雙鏈DNA病毒[4-5]。ORFV基因組全長138 kb，G+C含量高達63%～64%[6]。ORFV基因組在其末端都有一個反向重復序列，且末端基因是可變區，常常與毒力、免疫調節和發病機制等有關[7]。細胞因子是由免疫細胞(比如T細胞、B細胞、巨噬細胞等)和某些非免疫細胞(如內皮細胞、表皮細胞等)經刺激而合成和分泌的一類高活性的小分子蛋白質。ORFV的感染過程中，宿主細胞可釋放大量的細胞因子(如 IL-6、IL-8、TNF-α 等)參與免疫炎癥反應，ORFV自身也能夠產生抗炎蛋白來逃避宿主免疫反應。如黃忍等[8]研究發現，作為ORFV編碼的末端129蛋白可抑制山羊睪丸細胞內免疫效應分子IL-1β、IL-6和IFN-γ的表達。ORFV 121蛋白可通過與細胞質NF-κB-p65 相互作用，抑制p65 Ser536磷酸化和核轉運，從而阻止免疫相關基因的轉錄和翻譯[9]。由此可見，宿主的免疫系統在機體抗ORFV過程中發揮著重要的作用[10]。同時，朱曉琴等[11]、羅杰等[12]發現，IL-6、IL-1β和IL-8可促進體外培養的星形膠質細胞和大鼠動脈平滑肌細胞的增殖。INF-γ可明顯地抑制人骨肉瘤細胞株增殖現象[13]。由此可見，細胞因子的分泌在反應宿主細胞對抗病毒的免疫應答效應的同時，推測其對細胞周期也產生一定的影響。然而細胞周期和細胞凋亡密切相關，細胞增殖現象的表現也一定程度上反映細胞凋亡的水平[14]。ORFV118是羊口瘡病毒基因組末端變異區的一片段，目前對其研究主要為ORFV118作為一種免疫原性蛋白，可以通過刺激機體發生免疫應答，進而局部產生強烈的炎癥反應[15]，而對其細胞周期、凋亡及誘導機體發生免疫應答的機制目前仍不清楚。

本研究旨在克隆羊口瘡病毒ORFV118基因并對其進行生物信息學分析；隨后將構建的表達載體pEGFP-ORFV118轉染山羊睪丸支持細胞，利用實時熒光定量檢測技術分析ORFV118蛋白對機體免疫應答相關的4種細胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ及TNF-α)表達水平的影響，同時檢測ORFV118蛋白對細胞周期及凋亡的作用，研究結果可為進一步研究ORFV118在誘導機體免疫應答及全面揭示該蛋白的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 毒株、細胞和載體

羊口瘡病毒JYY-ORFV株為由西南民族大學動物醫學實驗室分離、鑒定保存；pEGFP-NI載體和山羊睪丸支持細胞由本實驗室保存；DH5α為寶生物工程(大連)有限公司產品。

1.2 主要試劑及儀器

PremixTaq、T4DNA連接酶、DL2000 DNA Marker、SYBR?Premix ExTaqTM(2×)均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、pMD19-T載體購自OMEGA公司；Hind Ⅲ、BamH Ⅰ為上海玉博生物公司產品； DMEM培養基和胎牛血清均為Gibco公司產品；青霉素-鏈霉素購自Hyclone公司；Lipofectamine 3000轉染試劑盒購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；TRIzol、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒、QuantStudio3購自美國Thermo Fisher Scientific公司；細胞周期及凋亡檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；山羊IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α ELISA檢測試劑盒購自睿信生物公司；流式細胞儀購自日本SYSMEX公司；熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；氯仿、異丙醇、DEPC等其他試劑均為國產試劑。

1.3 ORFV118基因的克隆鑒定及真核重組表達載體的構建

參照GenBank登錄的ORFV SY17株的基因組序列(登錄號：MG 712417.1)，Primier Primer 5軟件設計1對特異性引物為P1：5′-CGGGATCCATGTCATTTCAACGGGGCA-3′；P2：5′-CCAAGCTTTTAGCGGGAGTAGCCGTC-3′。以提取的羊口瘡病毒的DNA為模板，擴增ORFV118基因。PCR反應體系(25 μL)為200 ng/μL DNA模板1 μL，10 μmol/L Pre mixTaq 12.5 μL，10 μmol/LP1和P2引物各1 μL，ddH2O補足。反應條件如下：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 25 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃最后延伸7 min。PCR產物經2%的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測條帶正確后進行膠回收，并將其連接至pMD19-T載體，轉化DH5α，經菌落PCR和測序鑒定后質粒命名為pMD19-ORFV118。

構建真核表達載體pEGFP-ORFV118選擇Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制性內切酶，亞克隆引物如下，上游引物5′-AAGCTTATGTCATTTCAACGGGGCAA-3′(劃線部分為HindⅢ酶切位點)；下游引物5′-GGATCCTTAGCAGGAGTAGCCGTCAC-3′(劃線部分為BamHⅠ酶切位點)。以質粒pMD19-ORFV118為模板，亞克隆引物擴增，將擴增的片段連接到載體pEGFP-N1并轉化，雙酶切及測序正確后保存，構建真核表達載體pEGFP-ORFV118。

1.4 ORFV118基因的生物信息學分析

使用ProtParam在線軟件分析ORFV118基因的理化性質；SignalP 4.1分析信號肽；Protscale分析疏水性；TMHMM Server v.2.0分析蛋白跨膜結構域；SOPMA和SWISS-MODEL分別進行二、三級結構分析；采用NetNGlyc 1.0和NetPhos 3.1分別預測ORFV118蛋白N糖基化位點和磷酸化位點；在線軟件WOLF進行蛋白亞細胞定位預測。

1.5 山羊睪丸原代細胞的復蘇及pEGFP-ORFV118重組質粒的轉染

將本實驗室保存的第6代山羊睪丸細胞復蘇至6孔板[16]，細胞匯合度達70%～90%，按照脂質體轉染法將質粒pEGFP-ORFV118轉染至細胞，并以空載體pEGFP-N1為陰性對照，以正常生長的細胞為空白對照。轉染48 h后，提取細胞總RNA，檢測轉錄動力學，具體步驟參考文獻[8]。

1.6 檢測ORFV118蛋白在山羊睪丸原代細胞中的蛋白表達

按照1.5步驟操作，轉染48 h后，按照蛋白提取試劑盒說明書收集細胞總蛋白，以鼠抗GFP抗體(1∶500)為一抗，HRP-兔抗鼠IgG(1∶10 000)為二抗，通過Western Blot檢測ORFV118蛋白的蛋白表達水平。試驗共設置2組，分別為pEGFP-ORFV118轉染組、pEGFP-N1空載轉染組，且每組3個重復。

1.7 ORFV118蛋白對睪丸支持細胞4種細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ)表達水平的影響

參照1.5的步驟，轉染前0 h和轉染后48 h，分別收集細胞RNA樣和細胞上清液，用RT-qPCR和ELISA檢測細胞內外的IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α表達情況，RT-qPCR引物見表1。反應體系(20 μL)為：SYBR?Premix ExTaqTM10 μL，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，100 ng/μL的模板1 μL，ROX 0.2 μL，ddH2O補足。反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，同步采集熒光信號，72 ℃ 30 s，一共35個循環，熔解曲線：95 ℃變性15 s，60 ℃冷卻1 min，使DNA雙鏈充分結合，最后從60 ℃逐步加熱至95 ℃，每一步增加0.15 ℃并保持1 s，同時采集熒光信號。以GAPDH為參比基因，每個待測樣本設置3個重復。細胞上清液參考ELISA試劑盒說明書檢測ORFV118對睪丸支持細胞上清中IL-1β和IFN-γ的分泌情況。

表1 細胞因子的引物序列表1 Primer sequences of cytokine

1.8 ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞周期及周期相關基因的影響

參照1.5的步驟，轉染后48 h收集細胞，PBS洗滌2次，95%乙醇固定過夜，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，向細胞中加入400 μL碘化丙啶染色液，吹打混勻，37 ℃避光30 min，用流式細胞儀進行檢測。根據GenBank公布的山羊周期相關基因CDK2和牛的P21序列，設計引物，引物序列見表2。RT-qPCR檢測周期相關基因的mRNA表達水平(UXT為內參基因)。RT-qPCR反應體系和條件同1.7。

1.9 ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞凋亡及凋亡相關基因的影響

參照1.5的步驟，轉染后48 h收集細胞，PBS洗滌2次，使用Binding Buffer緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V/FITC，室溫避光5 min，再加入10 μL碘化丙錠溶液(PI)，并加400 μL PBS，立刻進行流式檢測。根據GenBank 公布的山羊凋亡相關基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase7序列以及牛凋亡相關基因p53、BCL2L11序列設計引物，引物序列見表2。RT-qPCR檢測凋亡相關基因的mRNA表達水平(UXT為內參基因)。RT-qPCR反應體系和條件同1.7。

表2 細胞周期及凋亡相關基因的引物序列Tab.2 Primers sequences of cell cycle and apoptosis-related genes

1.10 數據統計與分析

運用2-ΔΔCT方法分析ORFV118蛋白對4種細胞因子mRNA水平的影響，其中ΔCt=Ct細胞因子-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt細胞因子48 h-ΔCt細胞因子0 h。計算結果在SPSS 22.0中進行單因素方差分析和顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。分析ORFV118蛋白對周期或凋亡相關基因的mRNA水平時，采用2-ΔΔCT方法進行分析，其中ΔCt=Ct周期或凋亡相關基因-CtUXT。并將計算結果在SPSS 22.0中進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 ORFV118基因的PCR擴增、克隆鑒定

成功擴增ORFV118基因，瓊脂糖凝膠電泳可檢測與預期大小相符的片段(圖1-A)。克隆轉化后，菌落PCR檢測顯示，與預期的ORFV118基因的大小相符(圖1-B)。

A.ORFV118基因PCR擴增； B.質粒pMD19T-ORFV118的PCR擴增。M.2 000 bp DNA ladder；P.陽性對照；N.陰性對照；1.ORFV118基因。圖4同。

2.2 ORFV118基因的生物信息學分析

生物信息學分析結果顯示，ORFV118基因309 bp，共編碼102個氨基酸。分子質量為11.58 ku；蛋白呈親水性(圖2-A)，無信號肽(圖2-B)，為不穩定的非分泌性蛋白；同時，無保守結構域(圖 2-C)和跨膜結構域(圖2-D)；二級結構顯示(圖2-E)，α螺旋占17.65%，β螺旋占2.94%，無規卷曲為68.63%，延伸鏈為10.78%。三級結構結果如圖2-F。在第7，87位氨基酸處有2個N糖基化位點(圖2-G)；ORFV118蛋白有11個絲氨酸、2個蘇氨酸和3個酪氨酸磷酸化位點(圖2-H)。亞細胞定位顯示，該蛋白主要定位于細胞核(圖2-I)。

A.ORFV118蛋白的疏水性分析；B.ORFV118蛋白的信號肽預測；C.ORFV118蛋白的跨膜結構域分析；D.ORFV118蛋白的保守結構域預測；E.ORFV118蛋白的二級結構預測；F.ORFV118蛋白的三級結構預測；G.ORFV118蛋白的糖基化位點預測；H.ORFV118蛋白的磷酸化位點預測；I.ORFV118蛋白的亞細胞定位分析。

2.3 ORFV118基因真核重組表達載體的構建及鑒定

真核表達載體pEGFP-ORFV118經Hind Ⅲ、BamH Ⅰ雙酶切后電泳鑒定獲得的目的基因與預期條帶大小相符(圖3)，表明構建的質粒正確。

M.5000 DNA Ladder；1.pEGFP-ORFV118的Hind Ⅲ、BamHⅠ雙酶切鑒定。M.5000 DNA Ladder；1.pEGFP-ORFV118 digested by Hind Ⅲ and BamHⅠ.

2.4 pEGFP-ORFV118重組質粒在睪丸支持細胞的mRNA表達水平分析

轉染48 h后，提取細胞總RNA，通過RT-PCR也能擴增到與預期ORFV118基因大小相似的目的條帶，表明ORFV118基因在細胞中發生了轉錄(圖4)。

圖4 RT-PCR檢測pEGFP-ORFV118重組質粒的mRNA表達分析Fig.4 mRNA analysis of pEGFP-ORFV118

2.5 ORFV118蛋白在山羊睪丸支持細胞中的表達分析

Western Blot 結果顯示(圖5)，轉染空載pEGFP-N1的山羊睪丸支持細胞內僅可見GFP蛋白(25 ku

圖5 ORFV118蛋白表達的Western Blot鑒定Fig.5 Western Blot identification of ORFV118 protein

2.6 4種細胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)的表達水平分析

結果顯示，轉染48 h后，與空載體pEGFP-N1相比，在轉染pEGFP-ORFV118的細胞中，IL-1β和IFN-γ的mRNA轉錄和蛋白水平均受到了不同程度的抑制，而IL-6和TNF-α的mRNA轉錄和蛋白水平受到一定程度的促進(圖6)。

不同小寫字母表示處理較對照在0.05水平上差異顯著；不同大寫字母表示處理較對照組在0.01水平上差異極顯著。圖7—8同。Different lowercase letters indicate significant difference at the level of 0.05 between the treatment and the control；Different capital letters indicate extremely significant difference at the level of 0.01 between the treatment and the control.The same as Fig.7—8.

2.7 ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞周期及周期相關基因的影響

細胞周期結果顯示(圖7-A、B)，與空載體pEGFP-N1相比，轉染pEGFP-ORFV118組S期細胞數減少(P<0.05)；與空載體pEGFP-N1相比，轉染pEGFP-ORFV118組G2/M期細胞數增加(P<0.01)，可見ORFV118蛋白對細胞的DNA合成期(S期)有阻滯作用，對DNA合成后期(G2/M期)具有促進作用。周期相關基因檢測結果顯示，與空載體pEGFP-N1相比，ORFV118蛋白可上調基因CDK2的mRNA表達水平(P<0.01)，P21無統計學意義(P>0.05)(圖7-C、D)。

2.8 ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞凋亡及凋亡相關基因的影響

結果顯示，轉染pEGFP-N1組的細胞早期凋亡率是25.39%，晚期凋亡率為27.02%；pEGFP-ORFV118轉染組細胞的早期凋亡率是23.56%，晚期凋亡率為18.68%。可見，ORFV118蛋白抑制了細胞的凋亡作用(圖8-A、B)。凋亡基因結果顯示，與陰性對照組相比，ORFV118蛋白可極顯著下調促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA水平(P<0.01)。Bcl-2、BaX、BCL2L11、P53、PARP1無統計學意義(P>0.05)(圖8-C)。

A.pEGFP-N1對山羊睪丸支持細胞凋亡的影響； B.pEGFP-ORFV118對山羊睪丸支持細胞凋亡的影響；C.RT-qPCR檢測凋亡相關基因的影響。A.Effect of pEGFP-N1 on apoptosis of goat testicular sertoli cells；B.Effect of pEGFP-ORFV118 on apoptosis of goat testicular sertoli cells C.Effect of RT-qPCR detect apoptosis-related genes.

3 結論與討論

羊口瘡病毒自1923年被發現后，直到1957年被首次分離獲得[17]。隨著養羊業的擴大，飼養管理的不善，導致羊口瘡病毒迅速在世界范圍內擴展開來。由于感染口瘡的羊群導致其采食量下降，易引起其他疾病繼發感染、機體消瘦、生長緩慢等現象，該病的發生對整個養羊業造成重大的經濟損失[18-19]。目前，對于羊口瘡病毒的治療主要還是集中于對癥治療，尚無商品化的疫苗，因此，探究羊口瘡病毒致病機理對養羊產業的健康發展是十分必要的。本研究在過表達ORFV118基因的基礎上，探究了ORFV118蛋白調控新生山羊睪丸原代細胞免疫應答相關的4種細胞因子(IL-6、IFN-γ、IL-1β及TNF-α)的mRNA表達水平的影響，為進一步探討ORFV118在誘導機體免疫應答中的作用，以及對羊口瘡病毒疫苗以及新藥物的研發奠定一定的基礎。

生物信息學的分析可在一定程度指導基因存在的潛在生物學功能[20]。本研究成功克隆羊口瘡病毒ORFV118基因的全長，長度為309 bp。對其生物信息學分析發現，該蛋白共編碼102個氨基酸，分子質量約為11.58 ku，為不穩定蛋白；結構與功能預測顯示，該蛋白無信號肽，無跨膜結構域，為非分泌性蛋白；Khoury等[21]研究發現，蛋白質翻譯后存在磷酸化、糖基化和乙酰化等方式。本研究對ORFV118蛋白修飾結構的預測發現118蛋白在第7和87位氨基酸處有2個N糖基化位點；ORFV118蛋白有11個絲氨酸、2個蘇氨酸和3個酪氨酸磷酸化位點，推測這些位點可能是調控ORFV118蛋白功能的一些關鍵位點。同時，二級結構預測顯示，該蛋白以無規卷曲為主，提示該蛋白結構松散、不穩定。

支持細胞、間質細胞和生精細胞是山羊睪丸的3種細胞類型[22]。其中支持細胞可參與阻止外來抗原進入曲細精管，防止抗原和抗體之間產生的免疫應答[23]，且支持細胞分泌物可通過抑制淋巴細胞增殖，從而減少器官移植中的免疫排斥反應。細胞因子可通過睪丸細胞自分泌、旁分泌或者內分泌等形式產生，并通過局部調節或信號通路途徑影響睪丸的功能[24]。同時，ORFV可感染山羊睪丸細胞，并引起肉眼可見的空斑，且會刺激宿主產生多種細胞因子，參與機體的免疫調節、抗病毒等作用[25]。因此，細胞因子的準確定量對評價生物機體免疫狀態具有重要參考作用[26]。研究顯示，在病毒感染后，病毒誘導宿主細胞NF-κB等信號通路的活化，產生以IL-1α、IL-6和IL-8細胞因子為主的信號分子，調節機體的免疫應答[27]。本試驗中發現，ORFV118基因轉染山羊睪丸支持細胞后可導致IL-1β和IFN-γ的表達水平明顯低于陰性對照組，而IL-6、TNF-α的表達水平呈一定的上升趨勢，提示ORFV118蛋白可通過調節細胞內IL-1β、IFN-γ、IL-6和TNF-α的合成和分泌的能力，進而影響機體的免疫功能。

病毒感染與宿主是一個相互博弈的過程[28-29]，通過長期的進化過程，病毒為了能使其在宿主細胞內生存，可通過各種策略來對抗宿主的防御機制[30-31]。細胞凋亡作為其中的一種，是宿主細胞應對病毒感染的重要防御作用之一。例如痘病毒家族的痘苗病毒(Vacciniavirus，VACV)編碼的F1L蛋白[32]、黏液瘤病毒(Myxomavirus，MYXV)24，25[33]編碼的M11L蛋白和鼠痘病毒(Ectromeliavirus，ECTV)27[34]編碼EVM025蛋白已被證實對宿主細胞具有抗凋亡作用。且彭建偉[35]在研究中發現，ORFV125能抑制宿主細胞凋亡，隨著時間的延長，ORFV125蛋白對宿主細胞抑制作用更加明顯。ORFV118基因是羊口瘡病毒兩端相對不保守的基因之一，這些基因常常與宿主選擇、免疫逃逸、免疫調節及病毒毒力等有關。目前，ORFV118蛋白是否對宿主細胞的凋亡產生影響尚不清楚。本研究發現，ORFV118蛋白抑制山羊睪丸支持細胞凋亡現象，且下調促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表達水平，而對凋亡基因BaX、BCL2L11、P53、PARP1無影響。同時，本研究發現ORFV118蛋白對細胞的DNA合成期(S期)有阻滯作用，對DNA合成后期(G2/M期)具有促進作用，且下調基因CDK2的mRNA表達水平，而對周期基因P21的mRNA表達水平無影響。具體ORFV118蛋白誘導細胞凋亡的作用機制以及如何調控細胞周期仍需進一步確定。

ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞的DNA合成期(S期)有阻滯作用，對DNA合成后期(G2/M期)具有促進作用，且下調基因CDK2的mRNA表達水平。ORFV118蛋白可抑制細胞凋亡，且下調促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表達水平；ORFV118蛋白對細胞因子IL-1β和IFN-γ起到了不同程度的抑制作用，而對IL-6和TNF-α呈促進作用。這些結果為進一步探討ORFV118蛋白在誘導機體免疫應答及全面揭示該蛋白的功能奠定了基礎。