基于網絡藥理學研究血必凈注射液治療有機磷中毒的分子機制

鐘志濤，洪義，黃浩峰，趙敏

（中國醫科大學附屬盛京醫院急診科，沈陽 110004）

有機磷中毒是臨床常見的急危重癥，具有發病快、病情變化迅速、死亡率高等特點［1］。主要臨床表現為乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE） 活性嚴重降低，毒蕈堿樣、煙堿樣癥狀及中樞神經系統等癥狀，以及各種原因誘導的全身多臟器功能損傷。臨床上有機磷中毒采用復能劑、阿托品等對癥治療方案［2］。

血必凈注射液組方為紅花、赤芍、川芎、丹參和當歸，具有活血化瘀、扶正固本、清熱解毒等功效，對全身炎癥反應綜合征、膿毒血癥有一定的治療作用［3-4］。有研究［5］表明血必凈注射液能抑制有機磷中毒全身炎癥反應、減輕心血管損傷、改善凝血功能等作用。血必凈注射液與血液凈化、復能劑等聯合使用能夠改善患者預后及減少并發癥的發生［6］。

目前，有機磷中毒重癥患者仍缺乏有效及時的藥物檢測方法，難以準確調控“阿托品化”劑量。因此多種藥物聯合安全有效治療有機磷中毒尤為重要。本研究基于網絡藥理學，對血必凈注射液與有機磷中毒的復雜網絡關系進行分析，探討血必凈注射液治療有機磷中毒的分子機制，旨在為闡明血必凈注射液治療機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據收集

以“紅花”“川芎”“赤芍”“丹參”和“當歸”五味中藥材名稱在TCMSP數據庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php） “Herbname” 中進行檢索，通過口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、類藥性（druglike，DL） 對材料進行整理獲得藥物活性成分，通過TCMSP數據庫收集的活性成分導入Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/） 中得到血必凈注射液藥物靶點的基因名稱。以“organophosphorus pesticide poisoning”在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org） 和OMIM數據庫（https：//www.omim.org） 中檢索，收集有機磷中毒基因靶點并整理。

1.2 方法

1.2.1 交集靶點獲取：將血必凈注射液藥物活性成分靶點及有機磷中毒相關基因靶點導入在線工具Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），制作活性成分靶點和有機磷中毒靶點的韋恩圖，獲得其共同靶點基因，探究血必凈注射液對有機磷中毒治療的作用靶點。

1.2.2 活性成分-交集靶點網絡構建：將血必凈注射液藥物活性成分、各類藥物名稱、相關靶點及有機磷中毒相關基因等導入Cytoscape3.7軟件，構建活性成分-交集靶點網絡，使用Cytoscape3.7軟件中“Network Analyzer”計算連接度值，連接度值越高，表示其在網絡圖中的重要性越大，可能在疾病治療中發揮的作用也越大。

1.2.3 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI） 網絡制作：在STRING數據庫（http：//string-db.org）中導入藥物和疾病的交集靶點基因，以“homosapiens”為檢索物種，置信度≥0.4篩選數據，獲得并導出PPI網絡圖，將STRING數據庫檢索數據導出，整理并篩選出重要蛋白。

1.2.4 交集靶點的富集分析：在DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/） 中將1.2.1獲取的交集靶點基因導入并進行檢索，進行基因本體（gene ontology，GO） 分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 通路富集分析，篩選整理排序前20位關系密切的相關富集分析結果，采用R-studio軟件制作成柱狀圖。

2 結果

2.1 血必凈注射液的活性成分

以OB≥30%和DL≥0.18篩選TCMSP數據庫中血必凈注射液藥物活性成分，最后得到125個活性成分。OB值排序前15位（從高到低） 的活性成分見表1。

表1 血必凈注射液部分活性成分Tab.1 Some active ingredients in Xuebijing injection

2.2 血必凈注射液與有機磷中毒交集靶點構建

將血必凈注射液活性成分導入Uniprot數據庫獲得靶點217個，從GeneCards、OMIM數據庫檢索有機磷中毒獲得相關靶點279個，用Venny2.1繪制血必凈注射液與有機磷中毒交集靶點，最終得到69個共同靶點，這些共同靶點可能為血必凈注射液治療有機磷中毒的潛在靶點。

2.3 活性成分-交集靶點網絡圖

在Cytoscape3.7軟件中導入血必凈注射液與有機磷中毒交集靶點關系，繪制活性成分-交集靶點的網絡關系，見圖1。以連接度值大小排序，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇位于前三位，分別為52、51、28，表明這3個活性成分可能是血必凈注射液治療有機磷中毒的重要核心藥物活性成分。PTGS1、AR、ACHE為排名前三位的交集靶點基因，連接度值分別為42、27、27，表明這3個靶點基因可能是重要的治療靶點基因，CHRM2、ESR1、OPRD1、PPARG、CASP3、SLC6A3等基因也有較大的連接度值。

圖1 血必凈注射液活性成分-交集靶點網絡圖Fig.1 The active ingredient-intersection target network of Xuebijing injection

2.4 PPI網絡分析

將血必凈注射液與有機磷中毒交集靶點導入STRING數據庫中，獲得交集蛋白相互作用關系，見圖2。通過導出String數據庫數據，根據Betweenness Centrality、Closeness Centrality的均值篩選，結果顯示AKT1、ALB、CAT、CASP3、JUN、VEGFA等靶點連接度值較大，這些靶點可能在治療有機磷中毒中發揮重要作用。

圖2 PPI網絡分析圖Fig.2 Protein-protein interaction diagram

2.5 交集靶點的富集分析

在DAVID數據庫中導入交集靶點進行分析，如圖3所示，得到GO富集分析 1 217個，KEGG代謝通路144條。生物過程（biological process，BP） 1 122個，其中化學物質反應，氧化應激反應、活性氧反應、抗生素反應等富集程度較大；細胞組成（cellular component，CC） 28個，其中脂筏、膜微結構域、囊腔、分泌顆粒內腔等富集程度較大；分子功能（molecular function，MF） 67個，其中血紅素結合、四吡咯結合、磷酸酶結合、氧化還原酶活性、DNA結合轉錄因子結合等富集程度較大。KEGG排名前20條通路見圖4，包括流體剪切應力和動脈粥樣硬化、乙型肝炎、結腸直腸癌、膀胱癌、IL-17信號通路、前列腺癌、內分泌抵抗、糖尿病并發癥年齡-年齡信號通路、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染、細胞凋亡、胰腺癌、鉑耐藥、美洲錐蟲病、丙型肝炎、人類巨細胞病毒感染、T細胞受體信號通路、麻疹、腫瘤壞死因子信號通路、弓形蟲病、沙門氏菌感染等，血必凈注射液可能通過這些通路起到治療有機磷中毒的作用。

圖3 GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis

圖4 KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis

3 討論

利用網絡藥理學對藥物與疾病潛在的關系網絡進行分析，能夠促進藥物的研發和疾病的治療［7］。本研究結果顯示，有機磷中毒機制不限于對AChE的抑制，另一個重要機制是有機磷能誘導機體氧化損傷［8-9］。機體產生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS） 造成臟器直接損傷，還可介導信號通路生成炎癥介質，加重各器官損傷［10-11］。經現代藥理證實，血必凈注射液具有改善微循環、抗炎、抗氧化、抑制炎癥介質聚集與炎癥反應等功效，有助于抑制血小板聚集、調節機體免疫反應和改善血管內皮功能［1，12］。

本研究發現血必凈注射液治療有機磷中毒的主要核心活性成分為槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇等。槲皮素可能通過多種途徑減少氧化應激對細胞的損傷。盧春鳳等［13］發現槲皮素能減少氧化應激誘導的肝細胞損傷，可能與提高下游抗氧化基因的表達有關，從而抑制肝細胞凋亡。李冬梅等［14］發現槲皮素通過下調心肌髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO） 活性和心肌NF-κB的表達，對心肌產生保護效果。BAO 等［15］用槲皮素處理H2O2誘導的大鼠嗜鉻細胞瘤PC-12細胞，能提高細胞的生存能力，減少細胞和海馬神經元的凋亡，說明槲皮素能減少PC-12細胞對氧化應激誘導的凋亡。

木犀草素是一種天然類黃酮化合物，結構中含有的酚羥基基團有較強的還原性，從而使木犀草素具有抗氧化特性［16］。SEELINGER等［17］發現木犀草素可減少誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 的作用，降低iNOS的表達和一氧化氮（nitric oxide，NO） 產生。研究［18］發現木犀草素能夠抑制多種白細胞介素（interleukin，IL） 因子（IL-6等）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF） 等多種因子，增強IL-10的表達而發揮抗炎作用。

已有研究發現β-谷甾醇在抗氧化、抗炎、免疫調節等多個方面表現出良好的藥理作用。VALERIO等［19］認為β-谷甾醇可以提高脂多糖誘導的J774A1巨噬細胞抗炎因子IL-10的活性，下調趨化因子、促炎性細胞因子的表達，發揮抗炎作用。CHOI等［20］認為β-谷甾醇減少NO合成，IL-1、腫瘤壞死因子等炎性細胞因子的分泌，抑制IL-6活性來發揮抗炎作用。

活性成分-交集靶點圖與PPI網絡圖顯示AKT1、ALB、CAT、CASP3、JUN、VEGFA等可能是血必凈注射液治療有機磷中毒的重要靶點蛋白，目前相關蛋白與血必凈注射液、有機磷中毒的研究較少。KEGG通路分析提示血必凈注射液治療有機磷中毒相關通路涉及流體剪切應力和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、內分泌抵抗、細胞凋亡、T細胞受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等，這與現代藥理證實的部分作用相符合［1］，表明血必凈注射液可能通過多通路、多信號對有機磷中毒產生積極影響。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學分析了血必凈注射液與有機磷中毒的作用關系，從“多成分、多靶點”角度揭示了其可能的分子機制，認為血必凈注射液可能通過作用于AKT1、ALB、CAT、CASP3、JUN、VEGFA等關鍵靶點基因，調控流體剪切應力和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等來發揮治療效果。本研究結論是基于網絡藥理學原理，通過提取數據庫信息整理、分析而獲得，與實際作用機制可能存在差異，因此需要進一步實驗來驗證。