鼻咽癌外泌體通過LncTUG1促進內皮細胞增殖和血管生成*

王科 馬敏 蔣晉安 趙琳 張海鵬

(西安醫學院第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710100)

鼻咽癌是我國南方地區常見的頭頸部上皮性惡性腫瘤，Epstein-Barr病毒感染、飲食和遺傳因素與其病因有關[1]。放療是早期鼻咽癌患者的有效治療方法，但絕大多數(75%～90%)鼻咽癌患者在初診時已發生轉移，這阻礙了鼻咽癌的有效治療，并增加了疾病復發的風險[2]。腫瘤血管生成對腫瘤的生長、浸潤和轉移都有重要作用。腫瘤發展過程中，血管生成開關被激活，從而導致血管增生。血管生成開關的激活受腫瘤細胞或腫瘤微環境所引起的各種因素的調節[3]。因此，探究腫瘤血管生成的機制對于腫瘤治療具有重要意義。長非編碼RNA(Long noncoding RNAs，LncRNAs)通過調控癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等過程，參與調控癌癥的發生和發展[4]。外泌體是一種直徑為30～150 nm的膜狀囊泡，其可通過攜帶蛋白質和遺傳物質(DNA、LncRNA、miRNA和mRNA)等分子貨物，介導細胞間信息轉導，在腫瘤中發揮多種生物學功能[5]。先前的研究表明，長非編碼RNA牛磺酸上調基因1(Long noncoding RNA taurine upregulated gene 1，LncTUG1)在多種腫瘤中高表達，可通過調控腫瘤細胞周期及血管生成參與腫瘤的發生、發展過程[6]。目前，關于LncTUG1在鼻咽癌中的具體作用機制尚不明確。基于此，本研究旨在探究鼻咽癌外泌體中LncTUG1對內皮細胞(HUVECs)增殖和血管生成的作用，以期為鼻咽癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人鼻咽癌細胞株CNE1、CNE2、HONE1、正常鼻咽上皮NP69和人臍靜脈內皮細胞購自中科院上海細胞庫；PKH67試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；ActinRed購自美國Invitrogen公司；CD63、CD9、TSG101和GAPDH抗體購自英國Abcam公司；SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本Takara公司；sh-LncTUG1-1、sh-LncTUG1-2、sh-LncTUG1-3和sh-NC由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)購自大連美侖生物技術有限公司；Matrigel基質膠購自美國BD Biocoat公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 CNE1、CNE2、HONE1和NP69細胞用含10% FBS的RPMI-1640培養基于37℃、5% CO2培養箱中培養，HUVECs 用含10% FBS的DMEM/F12培養基于37℃、5% CO2培養箱中培養。所有細胞每2天更換一次培養基。

1.2.3 細胞轉染 將CNE1細胞按4×105個/孔密度接種于6孔板，于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，將細胞隨機分為Blank組、sh-NC組、sh-LncTUG1-1組、sh-LncTUG1-2組和sh-LncTUG1-3組，每組設置3個重復。按照Lipofectamine2000TM說明書進行sh-NC、sh-LncTUG1-1、sh-LncTUG1-2和sh-LncTUG1-3的轉染。另外，將細胞隨機分為CNE1-sh-NC組和CNE1-sh-LncTUG1組，每組設置3個重復。按照Lipofectamine2000TM說明書進行sh-NC和sh-LncTUG1(干擾效率最高的sh-LncTUG1)的轉染。37℃、5% CO2條件下培養48 h后，進行后續實驗。

1.2.4 外泌體的分離及鑒定 ①外泌體的分離：將對數期生長的NP69和CNE1細胞接種于培養皿中，添加含10% FBS的無外泌體的培養基，37℃、5% CO2條件下培養72 h，待細胞密度達到80%～90%時，收集細胞培養上清液。2000 g離心20 min，去除沉淀；10000 g離心30 min去除沉淀。上清液用超速離心機4℃、100000 g離心70 min，無菌PBS重懸沉淀后，重復此步驟一次。沉淀用無菌PBS重懸后，0.22 μm濾器過濾，所得分別為NP69和CNE1細胞來源外泌體，簡稱NP69-Exo和CNE1-Exo。用轉染了sh-NC和sh-LncTUG1的CNE1細胞，按照以上實驗步驟進行分離，所得的外泌體分別命名為CNE1-Exo-sh-NC和CNE1-Exo-sh-LncTUG1。所有外泌體于-80℃條件下保存備用。②外泌體的鑒定：取適量NP69-Exo、CNE1-Exo、CNE1-Exo-sh-NC和CNE1-Exo-sh-LncTUG1置于銅網，3%磷鎢酸負染色液染色5 min，去除染色液。銅網晾干后，透射電鏡觀察外泌體形態。取適量NP69-Exo、CNE1-Exo、CNE1-Exo-sh-NC和CNE1-Exo-sh-LncTUG1，PBS稀釋，0.22 μm濾器過濾后，Nanosight納米粒度顆粒跟蹤分析儀進行外泌體粒徑檢測。Western blot實驗檢測外泌體標志性蛋白CD63、CD9、TSG101蛋白表達。

1.2.5 外泌體標記示蹤 按照PKH67試劑盒說明書標記分離的CNE1-Exo，用10% FBS的RPMI-1640培養基停止過度染色。PBS清洗外泌體后，將外泌體加入HUVECs中，37℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，HUVECs細胞骨架用ActinRed染色，并用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)復染細胞核。激光共聚焦顯微鏡觀察HUVECs中外泌體的攝取情況。

1.2.6 Western blot檢測外泌體標志性蛋白CD63、CD9和TSG101蛋白表達 收集外泌體或細胞，RIPA裂解液裂解外泌體或細胞，取上清，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE分離，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上。10%脫脂奶粉室溫封閉3 h，CD63抗體(1∶1000)、CD9抗體(1∶2000)、TSG101抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶2000)4℃孵育過夜， HRP標記二抗(1∶5000)室溫孵育1 h。 ECL發光液顯色，暗室曝光。

1.2.7 外泌體與HUVECs的共培養 HUVECs以4×105個/孔密度接種于6孔板，將HUVECs分為PBS組和CNE1-Exo組或PBS組、CNE1-Exo-sh-NC組和CNE1-Exo-sh-LncTUG1組，每組設置3個重復。按照分組，向細胞中添加50 μg/mL CNE1-Exo、CNE1-Exo-sh-NC、CNE1-Exo-sh-LncTUG1和等量PBS。細胞繼續培養48 h后，進行后續實驗。

1.2.8 CCK-8檢測HUVECs細胞活力 HUVECs接種于96孔板，每孔5×103個細胞，繼續培養12 h后，將細胞分為PBS組和CNE1-Exo組或PBS組、CNE1-Exo-sh-NC組和CNE1-Exo-sh-LncTUG1組。按照分組，向細胞中添加CNE1-Exo、CNE1-Exo-sh-NC、CNE1-Exo-sh-LncTUG1和等量PBS。細胞繼續培養12、24、48和72 h后，向每孔細胞中加入10 μL CCK-8，37℃條件下孵育3 h。酶標儀測定各孔在450 nm處的光密度(OD)值。

1.2.9 5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)實驗檢測HUVECs細胞增殖 取1.2.7中的HUVECs以2×105個/孔數量接種于24孔板中，培養12 h后，根據說明書，向細胞中添加EdU至終濃度為10 μm。繼續培養2 h后，棄去培養基， 4%多聚甲醛固定15 min，0.5%Triton X-100穿透20 min， Apollo?567避光染色30 min， DAPI染核5 min。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞，其中藍色熒光代表細胞核，紅色熒光代表EdU陽性細胞。

1.2.10 Matrigel血管形成實驗檢測HUVECs血管形成能力 取1.2.7中的HUVECs，DMEM/F12培養基重懸細胞，以2×105個/孔細胞數量接種于加有Matrigel膠的24孔板，37℃、 5% CO2條件下培養10 h后，記錄各組細胞所有管狀結構交叉點數目。

其中，k∈[0,3]，i∈[1,Q]，Q=NSmax。因此，Q=2π/θ。另外，參數為兩個在[0,1]之間的隨機變量。當排除了以上4種充電失敗情況發生的概率后，可推得基于波束成形的一對一無線充電成功的概率為：

2 結果

2.1 LncTUG1在不同鼻咽癌細胞系中的表達及sh-LncTUG1干擾效率篩選 RT-PCR檢測結果顯示，CNE1、CNE2和HONE1細胞中LncTUG1表達水平均高于NP69細胞(P<0.01)，且CNE1細胞中LncTUG1表達水平最高，因此選取CNE1細胞進行后續實驗。sh-LncTUG1-1組、sh-LncTUG1-2組和sh-LncTUG1-3組CNE1細胞中LncTUG1表達明顯低于sh-NC組(P<0.01)，其中sh-LncTUG1-3組LncTUG1表達水平最低，因此選取sh-LncTUG1-3進行后續實驗，簡稱sh-LncTUG1。見圖1。

2.2 LncTUG1在鼻咽癌細胞來源外泌體中的表達水平 透射電鏡結果顯示， NP69-Exo和CNE1-Exo均呈圓形囊泡結構(圖2A)。粒徑分析顯示NP69-Exo和CNE1-Exo直徑約為100 nm(圖2B)。Western blot實驗結果顯示NP69-Exo和CNE1-Exo中外泌體標志性蛋白CD63、CD9、TSG101蛋白呈陽性表達(圖2C)。RT-PCR結果顯示，CNE1組中LncTUG1的表達明顯高于NP69組(P<0.001)，CNE1-Exo中LncTUG1的表達明顯高于NP69-Exo組(P<0.001)(圖2D)。激光共聚焦結果顯示，PKH67標記的外泌體可被HUVECs攝取，見圖2E。

圖2 LncTUG1在鼻咽癌細胞外泌體中的表達水平

2.3 CNE1-Exo對內皮細胞增殖的影響 RT-PCR實驗結果顯示，CNE1-Exo組內皮細胞中lncTUG1的表達明顯高于PBS組(P<0.001)(圖3A)；CCK-8實驗結果顯示，CNE1-Exo組在不同時間點的細胞活力明顯高于PBS組(P<0.05)(圖3B)；EdU實驗結果顯示， CNE1-Exo組EdU陽性細胞率明顯高于PBS組(P<0.001)，見圖3C。

圖3 CNE1-Exo對內皮細胞增殖的影響

2.4 外泌體對內皮細胞血管生成的影響 Matrigel成管實驗結果顯示，CNE1-Exo組HUVECs管狀網絡結構數量明顯高于PBS組(P<0.001)，見圖4。

圖4 外泌體對HUVECs血管生成的影響

2.5 LncTUG1在CNE1-Exo-sh-NC和CNE1-Exo-sh-LncTUG1中的表達 透射電鏡結果顯示，CNE1-Exo-sh-NC和CNE1-Exo-sh-LncTUG1均呈圓形囊泡結構(圖5A)。粒徑分析顯示CNE1-Exo-sh-NC和CNE1-Exo-sh-LncTUG1直徑約為100 nm(圖5B)。Western blot實驗結果顯示CNE1-Exo-sh-NC和CNE1-Exo-sh-LncTUG1中外泌體標志性蛋白CD63、CD9、TSG101蛋白呈陽性表達(圖5C)。RT-PCR結果顯示，CNE1-Exo-sh-NC組中LncTUG1的表達明顯高于PBS組(P<0.001)，CNE1-Exo-sh-LncTUG1組中LncTUG1的表達明顯低于CNE1-Exo-sh-NC組(P<0.001)，見圖5D。

圖5 LncTUG1在CNE1-Exo-sh-NC和CNE1-Exo-sh-LncTUG1中的表達

2.6 sh-LncTUG1對內皮細胞增殖的影響 CCK-8實驗結果顯示，CNE1-Exo-sh-NC組在12、24、48和72 h的細胞活力明顯高于PBS組(P<0.05)，CNE1-Exo-sh-LncTUG1組在24、48和72 h的細胞活力明顯低于CNE1-Exo-sh-NC組(P<0.05)。EdU實驗結果顯示，CNE1-Exo-sh-NC組EdU陽性細胞率明顯高于PBS組(P<0.001)，CNE1-Exo-sh-LncTUG1組EdU陽性細胞率明顯低于CNE1-Exo-sh-NC組(P<0.001)，見圖6。

圖6 sh-LncTUG1對HUVECs細胞增殖的影響

2.7 sh-LncTUG1對內皮細胞血管生成的影響 Matrigel成管實驗結果顯示，CNE1-Exo-sh-NC組HUVECs管狀網絡結構數量明顯高于PBS組，CNE1-Exo-sh-LncTUG1組HUVECs管狀網絡結構數量明顯低于CNE1-Exo-sh-NC組(均P<0.001)，見圖7。

圖7 sh-LncTUG1對HUVECs血管生成的影響

3 討論

鼻咽癌是一種具有特定地理分布的頭頸部腫瘤。據統計，2018年全世界約有13萬名患者受其影響，發病率最高的地區是華南、東南亞和北非。70%以上的患者在發病時被診斷為局部晚期疾病[7]。最近研究發現，LncRNAs在鼻咽癌組織中差異表達，LncRNAs參與原發性鼻咽癌的發病機制并與鼻咽癌復發相關[8]。已有研究表明，LncTUG1在腫瘤中發揮著致癌作用，敲低LncTUG1可抑制癌細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化過程，并誘導細胞凋亡[9]。目前，關于LncTUG1在鼻咽癌中的作用尚未可知。因此，本研究旨在探究LncTUG1對鼻咽癌血管生成的作用及其可能的作用機制，以期為鼻咽癌發病機制的探明和開發新的治療靶點提供新的科學資料。

在正常情況下，血管生成只發生在胚胎發育、女性生殖周期和傷口修復過程中。然而，異常血管生成是腫瘤發生發展的關鍵介質和主要過程[10]。腫瘤細胞利用各種細胞間通訊機制來適應局部微環境，操縱免疫系統，促進轉移。外泌體釋放是細胞間通訊的一種新機制。這些納米囊泡通過所運輸的核酸、蛋白質等活性物質參與腫瘤的發生發展[11]。研究表明，高轉移潛能的宮頸癌細胞來源外泌體通過向低轉移潛能癌細胞傳遞miR-29，促進低轉移潛能癌細胞轉移[12]。星形膠質瘤細胞來源外泌體中的miR-1246可通過靶向細胞黏附分子1，促進膠質瘤細胞增殖和轉移[13]。此外，骨肉瘤來源的外泌體中miR-1307的高表達可促進骨肉瘤細胞增殖并抑制細胞凋亡[14]。鼻咽癌細胞來源外泌體通過miR-9靶向MDK和調節PDK/AKT信號通路，抑制HUVECs血管生成和遷移[15]。本研究成功分離鼻咽癌細胞CNE1外泌體(CNE1-Exo)，隨后用CNE1-Exo處理HUVECs發現，CNE1-Exo可促進HUVECs增殖和血管生成。該研究結果表明，CNE1以外泌體的形式，促進HUVECs增殖和血管生成。

LncRNAs是超過200個核苷酸長的轉錄本，沒有編碼潛力，但其在腫瘤發生、發展過程中具有一定的致癌或抑癌作用[16]。已有研究表明，敲低LncTUG1可抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖并誘導凋亡，促進自然殺傷細胞殺傷敏感性[17]。LncTUG1在鼻咽癌細胞中高表達，抑制LncTUG1表達可顯著降低鼻咽癌細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化[18]。不難看出，LncTUG1可能是鼻咽癌診斷、預后和治療的有效靶點。本研究檢測了人鼻咽癌細胞株CNE1、CNE2、HONE1和正常鼻咽上皮NP69中lncTUG1的表達，發現LncTUG1在鼻咽癌細胞中呈高表達，其中CNE1表達差異最明顯。

一些研究表明，癌源性外泌體LncRNAs具有功能性，可以向鄰近細胞傳遞不同的表型模式，如耐藥性和血管生成增加[19]。外泌體LncRNAs在腫瘤早期診斷、治療監測和預后評估中具有潛在臨床應用價值[20]。用高表達LncSNHG14的乳腺癌細胞來源的外泌體處理癌細胞，可誘導其曲妥珠單抗耐藥性，而敲低LncSNHG14可消除這種作用[2]。LncMALAT1在轉移性上皮性卵巢癌細胞及其外泌體中表達上調。上皮性卵巢癌細胞外泌體中LncMALAT1通過外泌體轉移到受體HUVECs中，介導HUVECs促血管生成活性[22]。本研究結果顯示，LncTUG1在CNE1來源外泌體中高表達，用CNE1來源外泌體處理HUVECs后，HUVECs中LncTUG1表達升高，HUVECs增殖能力和血管生成能力升高；敲低LncTUG1后，CNE1來源外泌體中LncTUG1表達下調，對應的HUVECs中LncTUG1表達也下調，HUVECs增殖能力和血管生成能力受到抑制。

4 結論

鼻咽癌細胞外泌體通過LncTUG1促進HUVECs增殖和血管生成，在鼻咽癌進展中發揮重要作用。該研究結果為明確鼻咽癌的發病機制和開發新的臨床治療靶點提供了新的實驗依據。